Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparar soluções para experimentos
- Prepare a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) (consulte a Tabela de Materiais): Descongele a mistura de ECM no gelo. Diluir a mistura de ECM 1:10 em meio de cultura básico (sem fatores neurotróficos ou soro fetal bovino (FBS)) e armazenar em gelo.
- Prepare o meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais): Prepare um estoque de meio neurobasal que não contenha FBS ou Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF). Suplemente o meio neurobasal com FBS fresco (10%) e BDNF (5 ng/ml) antes de adicionar à cultura de células.
- Prepare a solução extracelular (consulte a Tabela de Materiais).
2. Lavagem e esterilização de MEAs
NOTA: Os MEAs usados para os experimentos contêm 68 eletrodos dispostos em uma grade retangular (Figura 1E). Cada eletrodo tem um tamanho de 40 x 40 μm2 com um espaçamento de 200 μm de centro a centro. Os eletrodos são feitos de platina. Os eletrodos são conectados aos contatos correspondentes por um circuito feito de óxido de índio e estanho. Este circuito é isolado por uma camada de 5 μm de SU-8. Consulte a tabela de materiais para obter detalhes sobre o provedor. Outros layouts MEA podem ser adequados para esses experimentos.
- Para novos MEAs: Enxágue-os imergindo em etanol a 70% por 30 segundos e lave com água destilada por 30 segundos. Trabalhe em uma capela de fluxo laminar.
- Deixe o MEA secar por 30 min em uma capela de fluxo laminar.
- Coloque cada MEA em uma placa de Petri estéril individual (35 mm x 10 mm) e sele com papel alumínio. Os MEAs podem ser armazenados até serem usados.
- Para MEAs usados: Incubar os MEAs em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) contendo 1 ml de solução enzimática (ver Tabela de Materiais) O/N em agitador orbital em RT para remover material biológico. Em seguida, continue como no passo 2.1.
nota: Manuseie os MEAs com cuidado usando uma pinça com pontas cobertas de borracha.
3. Preparação de MEAs para experimentos de cultura
- Retirar a folha de fecho e deixar o MEA na placa de Petri (35 mm x 10 mm) durante todo o ensaio.
- Revestir os MEAs com a solução preparada em 1.1: Utilizar uma ponteira de pipeta fria de 200 μl (conservada a -20 °C) para pipetar 50 μl de solução de revestimento para cada MEA, cobrindo toda a área do eléctrodo.
- Deixe os MEAs revestirem por 30 min a 1 hora em RT.
- Remova a solução de revestimento usando uma pipeta. Aplicar 100 μl de meio de cultura suplementado com 10% de FBS e 5ng/ml de BDNF e deixar em RT até o plaqueamento do tecido.
- Coloque 2 placas de Petri contendo os MEAs revestidos em uma placa de Petri grande (94 mm x 16 mm) e adicione uma terceira placa de Petri pequena contendo 1,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para umidificação.
nota: A adição de uma pequena placa de Petri (etapa 3.5) contendo PBS é crucial para minimizar significativamente a evaporação do meio de cultura.
4. Dissecção do gânglio espiral
NOTA: A dissecção macroscópica pode ser feita fora da capela de fluxo laminar (Etapa 4.1 a 4.4). Para a dissecção fina, são obrigatórias condições estéreis (capela de fluxo laminar) (a partir do passo 4.5).
- Eutanasiar animais (camundongos de 5 a 7 dias de idade) por decapitação sem anestesia prévia.
- Esterilize a cabeça pulverizando com etanol 70%.
- Segurando a cabeça, corte a conexão entre a pele e o crânio com uma tesoura afiada / afiada ao longo da linha sagital.
- Corte o crânio sagitalmente e remova o cérebro usando uma tesoura afiada / romba.
- Corte os ossos temporais do crânio e coloque-os em uma placa de Petri contendo solução salina balanceada de Hanks (HBSS) estéril e gelada.
- Usando um microscópio de dissecção, disseque a bolha timpânica usando uma pinça fina e isole o ouvido interno.
- Remova o osso da cóclea, usando uma pinça fina.
- Remova o ligamento espiral e a estria vascular (VS) juntos, segurando com uma pinça a porção basal do gânglio espiral (SG) e o SV e desenrolando lentamente o VS da base ao ápice
- Isole o órgão de Corti (OC), o GV e o modíolo (Figura 1A-C).
- Separe o CO do SG e do modíolo segurando com uma pinça a porção basal do GE e do CO e desenrolando lentamente o CO da base ao ápice.
- Corte explantes laterais (200 a 500 μm de diâmetro) do gânglio espiral ainda preso ao modíolo (Figura 1D) usando uma pinça e um microbisturi.
5. Cultura de explante de gânglio espiral em MEAs
- Colocar dois explantes de gânglios espirais junto aos eléctrodos do MEA previamente preparados com 100 μl de meio de cultura.
- Coloque o órgão de Corti a aproximadamente 5 mm de distância da área do eletrodo.
- Use uma pinça para fixar os explantes e o órgão de Corti no MEA, evitando danificar o tecido.
- Coloque os MEAs cuidadosamente na incubadora e cultive a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte, inspecione visualmente se os explantes foram anexados ao MEA.
nota: Se os explantes não tiverem O / N ligados, eles raramente o farão nos próximos dias. O CO é colocado adjacente à cultura para suporte trófico/neurotrófico.
- Adicione 100 μl de meio de cultura contendo 10% de FBS e BDNF diariamente por 5 dias consecutivos.
- No dia 6, adicione 2 ml de meio de cultura contendo 10% de FBS e 5ng/ml de BDNF e cultive o tecido por mais 13 dias.
