1. Semeadura de astrócitos para reprogramação
NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em um gabinete de segurança biológica com nível de segurança 1 (SL1).
- Prepare placas de 24 poços com lamínulas de vidro revestidas de poli-D-lisina da mesma forma que os frascos de cultura foram preparados anteriormente. Para determinar o número de placas necessárias, considere que os astrócitos são plaqueados a uma densidade de 5-5,5 x 104 células por poço em uma placa de 24 poços. Normalmente, isolar seis medulas espinhais de camundongos pós-natais no dia 2 (P2) produz cerca de 1 x 106 células.
- Aspire o meio dos frascos de cultura T25 contendo os astrócitos cultivados e lave uma vez com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Separe os astrócitos do frasco de cultura adicionando 0,5 mL de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,05% e incube a 37 ° C por 5 min. Bata suavemente na lateral do frasco para liberar as células da superfície do frasco de cultura e verifique o descolamento sob um microscópio de campo claro usando uma ampliação de 10X.
- Pare a tripsinização com 2,5 mL de meio de cultura de astrócitos e colete a suspensão celular em tubos de 15 mL. Centrifugue a 300 x g por 5 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio de cultura de astrócitos. Calcule a concentração celular usando um hemocitômetro ou um sistema automatizado de contagem de células.
- Com base no número de células, dilua a suspensão celular com meio de astrócitos frescos para obter uma solução de 1-1,1 x 105 células por mL. Suplementar o meio com fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a 10 ng/mL por fator. Adicionar 500 μL de suspensão celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada alvéolo das placas de 24 poços previamente preparadas e células de cultura a 37 °C e 5% de CO2.
2. Expressão forçada de fatores de transcrição
NOTA: Antes de prosseguir com o protocolo, é essencial projetar adequadamente o experimento. Em particular, é importante incluir sempre um controlo negativo para a reprogramação, ou seja, uma condição em que não é expresso qualquer factor de reprogramação. Por exemplo, ao usar vetores que transportam o cDNA para o fator de reprogramação e um repórter (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed), o controle negativo é representado pelo mesmo vetor carregando apenas o repórter. Ao expressar múltiplos fatores que transportam diferentes relatores, o controle negativo deve ser ajustado de acordo.
- No dia seguinte ao revestimento, inspecione as placas de 24 poços para certificar-se de que as células aderiram às lamínulas.
- Com base no objetivo experimental e nos recursos disponíveis, a expressão forçada de fatores de reprogramação pode ser alcançada por transdução viral (ver passo 2.3) ou transfecção de DNA (ver passo 2.4).
NOTA: O uso de retrovírus ou lentivírus requer a aprovação das autoridades governamentais e deve ser realizado sob um gabinete de segurança biológica dentro de um laboratório com nível de segurança 2 (SL2).
- Reprograme os astrócitos transduzindo as células com o retrovírus ou lentivírus que carrega a informação genética para expressar o(s) fator(es) de reprogramação de interesse, conforme descrito abaixo.
- Transduza células com um alto título de vírus de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/mL adicionando 1 μL da suspensão celular diretamente ao meio astrócito. Isso garante uma alta taxa de infecção. Cultivar as células com o meio de astrócitos contendo partículas virais a 37 °C por 24-36 h antes de prosseguir com a seção 3, dependendo do objetivo do experimento.
NOTA: Diferentes promotores podem ser usados para impulsionar a expressão dos transgenes (ver também Resultados representativos). Promotores constitutivos {por exemplo, citomegalovírus (CMV), galinha β-actina (CAG)} induzem a expressão do transgene mais cedo do que os promotores induzíveis; no entanto, ambos os tipos de tipos de promotores foram usados com sucesso para reprogramar células em neurônios.
- Os plasmídeos de DNA também podem ser introduzidos em astrócitos por meio de transfecção de DNA, conforme descrito abaixo.
nota: Isso pode ser feito sob um gabinete de segurança biológica aprovado para SL1.
- Antes da transfecção, obtenha o reagente de transfecção, um DNA de plasmídeo das construções desejadas, meio de astrócitos frescos e meio com soro reduzido (ver Tabela de Materiais). Calcule a quantidade necessária de meio com redução de soro (consulte a Tabela de Materiais) considerando que cada poço de uma placa de 24 poços requer 300 μL de meio com redução de soro. Adicione a quantidade adequada de meio com redução sérica a um tubo de 50 ml e aqueça-o a 37 °C.
- Quando o meio com redução sérica estiver quente, aspire o meio de astrócitos de todos os poços e colete-o em um tubo de 50 mL. Filtrar o meio astrócitos recolhido com um filtro de seringa de 0,45 μM para remover as células destacadas.
- Adicione um volume igual de meio de astrócitos fresco ao meio filtrado para obter uma solução suficiente para adicionar 1 mL de meio de astrócitos por alvéolo. Manter o meio condicionado de astrócitos na incubadora a 37 °C até à utilização (passo 2.4.9).
nota: O meio de cultura é reutilizado, pois contém vários fatores secretados que apóiam a viabilidade da cultura.
- Adicione 300 μL de meio pré-aquecido com redução de soro a cada poço e coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora.
- Preparar a solução A, constituída por ADN e meio soro-reduzido. Para cada poço, use um total de 0,6 μg de DNA e adicione-o a 50 μL de meio com redução sérica. Armazene a solução A em temperatura ambiente até o uso.
NOTA: Normalmente, um triplicado técnico por condição é considerado. Portanto, uma mistura suficiente para a reação 3,5 é preparada (por exemplo, 2,1 μg de DNA total diluído em 175 μL de meio com redução sérica) para garantir material suficiente para transfectar três poços de uma placa de 24 poços.
- Preparar a solução B, composta pelo reagente de transfecção e pelo meio soro-reduzido. Para cada poço, adicione 0,75 μL de reagente de transfecção a 50 μL de meio com redução sérica. Como esta solução é comum a todas as condições de transfecção, prepare-a a granel para reduzir a variabilidade entre as transfecções.
- Incube a solução B à temperatura ambiente durante 5 min. Adicione a solução B à solução A gota a gota na proporção de 1:1 e misture suavemente. Não vórtice. Incube a solução A+B por 20-30 min em temperatura ambiente sob o capô.
- Repita as etapas 2.4.5-2.4.7 para todas as condições de transfecção. Após 20-30 min, adicione a solução A+B a cada poço gota a gota para um volume final de 100 μL. Agite suavemente a placa e coloque as células de volta na incubadora a 37 °C por 4 h.
- Após 4 h, remova o meio de transfecção e adicione 1 mL do meio condicionado de astrócitos pré-aquecido preparado na etapa 2.4.3. Manter as células durante 36-48 h antes de prosseguir com a secção 3, dependendo do objectivo da experiência.
3. Reprogramação de astrócitos (análise de 7 dias)
- Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando 1 mL de suplemento de B27 a 49 mL de meio de cultura básico. Após 24-48 h, dependendo se as células foram transduzidas ou transfectadas (ver etapas 2.3 e 2.4, respectivamente), substitua o meio de astrócitos por 1 mL de meio de diferenciação neuronal por poço e células de cultura a 37 ° C e 9% de CO2.
NOTA: As células também podem ser mantidas a 5% de CO2 se não houver incubadora de 9% de CO2 disponível. No entanto, a reprogramação neuronal é mais eficiente nessas condições.
- Opcional: Para aumentar a eficiência da reprogramação, suplemente o meio de diferenciação neuronal com Forscolina (concentração final de 30 μM) e Dorsomorfina (concentração final de 1 μM) ao substituir o meio astrócitos por meio de diferenciação. Ao optar por tratar as células com Forscolina e Dorsomorfina, forneça uma segunda dose de Dorsomorfina 2 dias após o tratamento inicial. Adicione este segundo tratamento diretamente ao meio de cultura.
- A reprogramação direta de astrócitos murinos em células neuronais normalmente ocorre dentro de 7 dias após a mudança do meio (Figura 1). Assim, 7 dias após o início da reprogramação neuronal, fixe ou colete células para análise a jusante.
