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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Remoção do cérebro com raiz nervosa auditiva intacta para estimulação
NOTA: Os camundongos para esses experimentos foram obtidos cruzando camundongos transgênicos ChAT-IRES-Cre em um fundo C57BL/6J com camundongos repórteres tdTomato (Ai14). Os camundongos usados para histologia e eletrofisiologia foram pós-audição (P14-P23), que é em torno de P12 em camundongos. Os neurônios que expressam tdTomato no núcleo ventral do corpo trapezoidal (VNTB) foram previamente caracterizados como neurônios olivococleares mediais (MOC) nesta linhagem de camundongos.
- Eutanasiar (por exemplo, asfixia por CO2) e decapitar o animal usando procedimentos institucionais aprovados.
- Usando uma lâmina de barbear, corte a pele na linha média do crânio, do nariz até a nuca. Descasque a pele para expor o crânio.
- Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão no crânio através da linha média, começando na base (extremidade caudal perto da medula espinhal) do crânio e continuando em direção ao nariz.
- Na sutura lambda, faça cortes no crânio a partir da linha média, lateral em direção à orelha em ambos os lados. Descasque o crânio para expor o cérebro.
- Começando na extremidade rostral, levante suavemente o cérebro do crânio com uma pequena espátula de laboratório ou pinça romba. Corte o nervo óptico e continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral.
- Corte os nervos trigêmeos apertando-os com uma pinça fina perto da superfície ventral do tronco encefálico.
nota: Faça isso com cuidado, pois o nervo vestibulococlear fica logo abaixo dele e precisa estar intacto para eventual estimulação.
- Coloque a preparação em uma placa de Petri de vidro cheia de solução fria para fatiar. Coloque o prato sob um microscópio de dissecação. Polvilhe suavemente com carbogênio.
- Apare o nervo facial próximo ao tronco encefálico e exponha o nervo vestibulococlear.
- Usando uma pinça fina, empurre as pontas para o forame onde o nervo vestibulococlear sai do crânio o mais longe possível e aperte o nervo para cortá-lo, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral. Repita isso do outro lado.
- Quando ambas as raízes nervosas estiverem livres, remova as meninges e a vasculatura da superfície ventral do tronco encefálico perto do corpo trapezoidal.
- Liberte o cérebro completamente do crânio, beliscando os nervos cranianos e o tecido conjuntivo restantes, tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.
2. Bloquear e montar o cérebro no palco (disco magnético)
- Prepare a superfície do cérebro para se fixar no palco, bloqueando o cérebro no nível do quiasma óptico.
- Com a superfície ventral para cima, estabilize o cérebro usando uma ferramenta romba para imobilizar suavemente a medula espinhal para que o cérebro não se incline durante a etapa seguinte.
- No nível do quiasma óptico, use uma pinça aberta para criar o plano para bloquear o cérebro, inserindo-o através do cérebro até o fundo do prato. Insira a pinça em um ângulo de aproximadamente 20° da vertical para que as pontas saiam da superfície dorsal do cérebro caudal ao quiasma óptico.
- Corte ao longo da pinça usando a lâmina de barbear.
- Cole o cérebro na superfície do palco.
- Prepare um pequeno bloco (~ 1 cm3) de ágar 4% para apoiar o cérebro.
- Coloque uma pequena gota de cola no palco e espalhe-a em um retângulo para que o cérebro e o bloco de ágar possam ser colados.
- Usando uma pinça, levante cuidadosamente o cérebro e enxugue suavemente o excesso de líquido usando a borda de uma toalha de papel. Coloque a superfície bloqueada na cola, a superfície ventral estará voltada para a lâmina durante o corte.
- Empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal do cérebro para apoiá-lo durante o corte e garantir o posicionamento adequado do cérebro (ou seja, ângulo).
3. Fatie o cérebro para criar uma fatia de cunha
NOTA: Prepare uma fatia de cérebro usando um vibratomo que tenha a raiz nervosa coclear no lado grosso e os neurônios olivococleares mediais (MOC) e o núcleo medial do corpo trapezoidal (MNTB) no lado fino.
- Coloque o disco magnético com o cérebro anexado na base do palco e coloque-o na câmara de corte com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina.
- Encha a câmara com uma solução de corte gelada e borbulhe com carbogênio.
- Abaixe a lâmina na solução e corte as fatias caudais à região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Se as fatias parecerem assimétricas, incline ligeiramente o palco para obter simetria.
nota: Velocidades de lâmina entre 0,05-0,10 mm/s foram eficazes para o corte de fatias saudáveis e podem variar dependendo da idade do animal e da região do cérebro.
- Quando as fatias estiverem simétricas, desloque o estágio ~15° (correspondendo a aproximadamente 3 anéis concêntricos na base do palco) para um lado.
nota: Mude o palco para longe da raiz nervosa auditiva que você deseja preservar na fatia.
- Continue cortando com cuidado até que a raiz do nervo auditivo esteja próxima à superfície de um lado e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado.
- Desloque o stage de volta 15° para a posição original.
- Afaste a lâmina do tecido e gire a base do estágio 90° para que a borda lateral do lado fino fique voltada para a lâmina. Abaixe a lâmina várias centenas de mícrons e, em seguida, aproxime-a lentamente da borda do tecido. Repita isso até que a lâmina toque a borda lateral. Abaixe a lâmina até a espessura desejada da borda fina da fatia, aqui mais duzentos mícrons.
nota: A fatia resultante tem idealmente ~ 300 mm de espessura no nível do núcleo ventral do corpo trapezoidal (VNTB) no lado onde ocorrerá o patch clamping.
- Afaste a lâmina do tecido e gire a base do palco para trás de modo que a superfície ventral fique voltada para ela.
- Faça o corte que designa a superfície rostral da fatia em cunha. Transfira a fatia para um pedaço de papel de interface (1 cm2) com a superfície caudal para baixo. Mover a fatia para a câmara de incubação ou outro aparelho de incubação adequado para recuperação (30 min a 35 °C).
nota: O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios do corte na superfície rostral (ver Figura 1B).
