Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos

Abstract

Fonte: Fischl, M. J. et al., Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar a conectividade do circuito neuronal in vivo.J. Vis. Exp.(2020)

Este vídeo demonstra o processo de preparação de fatias de cérebro em forma de cunha em um ambiente de laboratório. Usando um vibratome, uma fatia em forma de cunha do cérebro de um camundongo é trabalhada com espessura variável. Esta fatia contém a raiz nervosa auditiva posicionada na extremidade mais espessa, enquanto os neurônios relacionados à audição estão localizados na extremidade mais fina.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Remoção do cérebro com raiz nervosa auditiva intacta para estimulação

NOTA: Os camundongos para esses experimentos foram obtidos cruzando camundongos transgênicos ChAT-IRES-Cre em um fundo C57BL/6J com camundongos repórteres tdTomato (Ai14). Os camundongos usados para histologia e eletrofisiologia foram pós-audição (P14-P23), que é em torno de P12 em camundongos. Os neurônios que expressam tdTomato no núcleo ventra....

Results

Figura 1: Esquema de fatia de cunha e imagem de exemplo. (A) Esquema do circuito de feedback olivococlear medial. As setas azuis indicam a via ascendente aferente para os neurônios MOC, e as setas pretas indicam a via de feedback descendente dos neurônios MOC para a base das células ciliadas externas (OHC). (B) Imagem de campo claro de uma fatia em cunha com rótulos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparações experimentais
Ágar, pó	Fisher Científico	BP1423500	Bloqueio de ágar 4% usado para estabilizar o tecido cerebral durante a seccionamento do vibratomo
AlexaFluor Hidrazida 488	Invitrogen	Rolamento A10436	Fluoróforo usado na solução interna para confirmar o patch de neurônio MOC bem-sucedido
Balança Analítica	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	Produtos químicos de pesagem
Lâmina de barbear de dois gumes	Ted Pella	121-6	Lâmina de corte vibratome
Ácido quinurênico (5g)	Sigma Aldrich	K3375-5G	Aditivo ACSF de fatiamento usado para reduzir a atividade dos neurônios durante a dissecção e fatiamento, a fim de melhorar a saúde do tecido para o clampeamento do remendo
Medidor de pH	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	Testador de pH de solução
Placas de Petri plásticas 100mm diâmetro X 20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	4% de preparação de ágar
Placa de aquecimento de agitação	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	Aquecimento para preparação de ágar 4%
Dissecção e fatiamento
Biocitina	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Produto químico usado para traçado axonal (conjugado com estreptavidina 488)
Microscópio de dissecação	Amscope	SM-1BN	Para dissecção precisa durante a remoção do cérebro
Dumont #5 Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Ferramenta de dissecção de pinça fina
Pinças econômicas #3	WPI	501976	Ferramenta de dissecção de pinça
Placa de Petri de vidro 150mm diâmetro x 15mm H	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	Prato de dissecação
Papel de interface (203 x 254 mm PCTE Membrane 10um)	Thomas Científico	1220823	Incubação de fatias/aplicação de biocitina
Leica VT1200S Vibratome	Leica	1491200S001	Vibratomo para seccionamento de fatias de cunha
Tesoura de maionese	Roboz	RS-6872	Ferramenta de dissecação
Lâminas de aço carbono de um gume	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	Lâmina de barbear para dissecação
Disco de amostra, orientação	Leica	14048142068	Estágio de vibratomo especializado para inclinação reprodutível
Colher	FisherSci	14-375-10	Ferramenta de dissecação
Super cola	Novo ovo	Rolamento 15187	Usado para colar tecido no estágio de vibratomo
Tesoura de mola Vannas	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91500-09	Ferramenta de dissecação