Estimulando a diferenciação celular neuronal usando nanobastões de ouro

Resumo

Fonte: Paviolo., et al. Estimulação óptica assistida por nanobastões de ouro de células neuronais. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra uma técnica para promover a diferenciação neuronal expondo as células nervosas a nanobastões de ouro e luz laser, que forma projeções celulares suportadas pela βIII-tubulina. A coloração e a observação da tubulina e do núcleo celular com microscopia de epifluorescência revelam as conseqüências celulares, indicando a eficácia dos nanobastões na diferenciação neuronal.

Protocolo

1. NG108-15 Cultura e Diferenciação de Linha Celular Neuronal

1. Para o meio de cultura celular, preparar 500 ml de meio Eagle modificado de Dulbecco estéril (DMEM) contendo 10% (p/v) de soro fetal de bezerro (FCS), 1% (p/v) de L-glutamina, 1% (p/v) de penicilina/estreptomicina e 0,5% (p/v) de anfotericina B.
   Nota: Os suplementos podem ser alíquotados, armazenados a -20 °C e adicionados ao meio no dia necessário. O meio de cultura celular pode ser refrigerado em condições estéreis por no máximo 1 mês.
2. Para o meio de diferenciação celular, prepare 50 ml de DMEM estéril contendo 1% (p / v) de L-glutamina, 1% (p / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (p / v) de anfotericina B.
3. Cultivar células neuronais NG108-15 em 10 ml de meio de cultura celular em frascos T75 de poliestireno numa incubadora com atmosfera humidificada (5% de CO2 a 37 °C). Normalmente, semeie 1,5-2 × 10⁵ células em cada frasco para estar pronto em 3-4 dias. Troque o meio de cultura celular a cada dois dias.
   Nota: Para evitar desvios ou variações genéticas, não use células mais antigas do que a passagem 21 para experimentos.
4. Quando 70-80% confluente na cultura, troque o meio por um meio de cultura de células frescas e quentes. Separar mecanicamente as células batendo suavemente no fundo do balão confluente. Não use tripsina.
5. Centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 600 x g e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio de diferenciação celular quente.
6. Semear 2 × 10⁴ células/^cm2 em uma placa de poliestireno de 96 poços de cultura de tecidos com 200 μl de meio de diferenciação celular. Incubar o experimento por 1 dia a 5% de CO2 / 37 °C.
7. Adicione entre 3,2 × 10⁹ - 4,2 ×^{10 10} partículas/ml de solução de nanobastões de ouro (Au NR) no dia 2 e incube-o por mais 24 horas. Não adicione as partículas para os experimentos de controle.
   Nota: Como controle alternativo, nanopartículas de ouro (Au NPs) com um comprimento de onda de absorção de pico bem diferenciado podem ser usadas para fins de comparação, Para um comportamento celular mais consistente, mantenha a densidade celular constante e não modifique a superfície do poço antes da semeadura celular.

2. Aumento do crescimento de neurite

1. Acople o laser a uma fibra óptica monomodo (abertura numérica = 0,13) e termine-o com um conector de fibra (os conectores FC são convenientes e comumente disponíveis). Meça a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Para obter os resultados mais eficazes, combine o comprimento de onda de pico do laser com o pico de ressonância plasmônica dos NRs.
2. No dia 3 após a incubação NR, fixe o conector FC no poço. Irradie amostras e controles em RT por 1 min em onda contínua para diferentes potências de laser. Deixe a cultura prosseguir por mais 3 dias a 5% de CO2 / 37 °C. Repita a irradiação do laser por um mínimo de 3 medições independentes.
   Nota: Diferentes tempos de irradiação e frequências de pulso podem ser selecionados dependendo da aplicação.
3. Caracterize o laser em termos de diâmetro do feixe e irradiância do laser (W∙cm-2).
   1. Para uma fibra monomodo padrão, use NA = n∙senθ, onde n é o índice de refração do meio em uso e θ é o meio ângulo do cone de luz que sai da fibra (ver Figura 1A). Da trigonometria, r = tanθ∙d, onde r é o raio do feixe e d é a distância entre a fibra e a amostra. O conector FC corresponde ao diâmetro do poço, iluminando a amostra a uma distância d = 2,70 ± 0,20 mm. A luz sai da fibra na água (n = 1,33), dando r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. Usando a última equação, calcule o raio do feixe de laser, a área do feixe correspondente e a irradiância média do laser (potência do laser dividida pela área do feixe) no alvo (veja o gráfico de exemplo na Figura 1B). Esses valores representam a irradiância média sobre a área iluminada.
   3. Avalie os erros para as medições com a teoria geral da propagação de erros.
      Nota: A distância entre o conector FC e a amostra pode ser medida por fotografias do arranjo experimental e pós-processamento da imagem usando software apropriado (por exemplo, ImageJ).
4. No dia 5, remova o meio de diferenciação celular dos experimentos e fixe as amostras com solução de formaldeído a 3,7% (v / v) por 10 min, depois permeabilize as células com Triton X-100 a 0,1% (v / v) por 20 min.
5. Adicione albumina de soro bovino (BSA) a 3% (p/v) às amostras por 60 min para bloquear os locais de ligação às proteínas que não reagiram. Rotular as amostras para anti-βIII-tubulina durante a noite (5 μg/ml em PBS suplementado com 1% de BSA) a 4 °C.
6. Incube as células por 90 min no escuro com um anticorpo secundário apropriado (por exemplo, anticorpo IgG de camundongo conjugado com TRITC (tetrametilrlamina)) usando uma concentração de 0,4-2 μg / ml em 1% BSA em PBS. Rotular os núcleos celulares com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindo) (0,1 μg/ml em água desionizada) durante 10 min.
   Nota: A conjugação e concentração de anticorpos podem variar de acordo com o protocolo da empresa. Lave as amostras com PBS duas vezes por 5 min após cada estágio de coloração.
7. Amostras de imagem por epifluorescência ou microscopia confocal usando uma objetiva de pelo menos 20×. Escolha os filtros do microscópio de acordo com o anticorpo secundário. Selecione um filtro DAPI (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm) para visualizar os núcleos celulares.
8. Analise as imagens avaliando: i) o comprimento máximo do neurite (registre o comprimento da ponta do neurite até o início do corpo celular), ii) o número de neurites por célula neuronal (some todos os neurites por célula) e iii) a porcentagem de células com neurites (divida o número total de células que expressam βIII-tubulina pelo número total de células com um núcleo corado positivamente)

Resultados

Figura 1. Configuração experimental de fibra óptica (A) e irradiâncias médias do laser em função da potência do laser para um feixe de laser de área igual a 0,4 mm2 (B). Os parâmetros do feixe são (A): o meio ângulo do cone máximo de luz que sai da fibra (θ), o raio do feixe (r) e a distância entre a fibra óptica e a amostra (d).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
Fcs	Tecnologias da Vida	10100147
L-glutamina	Sigma Aldrich	G7513
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias da Vida	15140122
Anfotericina B	Tecnologias da Vida	15290018
Formaldeído	Sigma Aldrich	Rolamento F8775
Tritão X-100	BDH	T8532
Bsa	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tubulina	Promega	G7121
Anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com TRITC	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Espectrômetro UV-Vis	Varian Sistemas Médicos Inc.	Cary 50 Bio
Mini centrífuga	Eppendorf	Mini Giro
Banho sônico	Unisonics Austrália	FPX 10D
Incubadora para cultura celular	Kendro	Hera Cell 150
Centrífuga para cultura celular	Hettich	Rotofix 32A
Diodo laser	Optotech	Fibra monomodo de 780 nm - LD acoplado
Fibra óptica	Thorlabs	780 HP
Medidor de energia	coerente	Verificação a laser
ImagemJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscópio epifluorescente	Axônio Instrumentos	Impressora ImageX 5000A
Pbs
Placa de poliestireno de 96 poços
CO2
Frascos T75