1. Preparação das soluções
- Mídia E2 (1x)
- Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando todos os componentes mostrados na Tabela 1. Soluções de autoclave E2A, E2B e E2C. Conservar a 4 °C.
- Para 1x meio E2: Combine 5 mL de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B e 1 mL de 500x E2C. Aumente o volume para 500 mL com água estéril. Ajuste o pH para 7,0-7,5.
- Prepare alíquotas de 50 mL de 1x meio E2 e armazene a -20 °C para armazenamento de longo prazo. No entanto, podem ocorrer precipitações após o descongelamento. Certifique-se de que a precipitação esteja totalmente dissolvida antes de usar a solução estoque.
Tabela 1: Componentes do meio 1x E2 para cultura de células de peixe-zebra.
| solução | componente | quantidade | concentração |
| 100X E2A (500mL) | | | |
| NaCl | 43,8 gramas | 1500 mM |
| Kcl | 1,88 gramas | 50 mM |
| MgSO4 | 6 g | 100 mM |
| KH2PO4 | 1,03 gramas | 15 mM |
| Na2HPO4 | 0,34 gramas | 5 mM |
| 500X E2B (100 mL) | | | |
| CaCl2 | 5,5 gramas | 500 mM |
| 500X E2C (100 mL) | | | |
| NaHCO3 | 3 gramas | 350 mM |
| 1X E2 (500 mL) | | | |
| 100X E2A | 5 ml | 1X |
| 500X E2B | 1 mL | 1X |
| 500X E2C | 1 mL | 1X |
- E3 Media (1x)
- Dissolva os componentes em 1 L de água estéril conforme mostrado na Tabela 2 para fazer 100x o estoque. Dilua o estoque em água estéril para fazer 1x mídia E3.
- Adicione 0,2% de azul de metileno. Para 20 mL de 1x meio E3, adicione 40 μL de azul de metileno.
Tabela 2: Componentes do meio 100x E3 para manutenção de embriões de peixe-zebra.
| componente | Montante (g) | Concentração em estoque 100X (mM) |
| NaCl | 29.22 | 500 |
| Kcl | 1.26 | 17 |
| CaCl2 2H2O | 4,85 | 33 |
| MgSO4 7H2O | 8.13 | 33 |
- Solução estoque de solução salina 80x
- Combine todos os componentes mostrados na Tabela 3. Adicione água para fazer 100 mL de solução. Misture até que todos os componentes estejam dissolvidos. Conservar a solução a 4 °C.
Tabela 3: Componentes da solução salina 80x para meios de cultura de células de peixe-zebra.
| componente | Montante (g) | Concentração em estoque (mM) |
| glicose | 1,44 | 80 |
| Piruvato de sódio | 0,44 | 40 |
| CaCl2 2H2O | 0,148 | 10 |
| HEPES | 6.1 | 256 |
- Meio de cultura de células de peixe-zebra (ZFCM+)
- Combine todos os componentes mostrados na Tabela 4 para fazer um meio de 250 mL. Ajuste o pH para 7,5. Filtrar o meio filtrante com filtro de 0,22 μm e conservá-lo a 4 °C.
Tabela 4: Componentes do meio de cultura de células de peixe-zebra com soro e antibióticos.
| componente | Quantidade (mL) | Volume % |
| L-15 médio (com vermelho de fenol) | 212,75 | 85.1 |
| Soro fetal bovino (FBS) | 5 | algarismo |
| Penicilina/estreptomicina | 1 | 0,4 |
| Solução salina 80X | 3.125 | 1.25 |
| Água | 28.125 | 11.25 |
2. Cultura primária de células ganglionares da retina derivadas de embriões de peixe-zebra
NOTA: Execute as etapas 2.1 e 2.2 em uma capela de fluxo laminar.
- Preparação de lamínulas
- Prepare 4-6 placas de cultura em cada experimento. Use lamínulas limpas com ácido (22 x 22 mm quadrados; 0,16-0,19 mm de espessura) armazenadas em etanol 100%.
- Remova uma lamínula do recipiente de armazenamento usando uma pinça e queime-a para remover o etanol residual.
- Seque completamente a lamínula ao ar, colocando-a em ângulo dentro de uma placa de cultura de 35 mm.
- Prepare a solução de trabalho de poli-D-lisina (PDL) (1x) diluindo 10x estoque (5 mg / mL) em água estéril.
- Aplique 100 μL de PDL 0,5 mg / mL no centro de cada lamínula e evite espalhar a solução nas bordas.
- Incube o PDL em lamínulas por 20-30 min em temperatura ambiente (RT). Certifique-se de que o PDL não seque.
- Lave o PDL com 0,5 mL de água estéril três vezes. Deixe as placas secarem completamente.
- Prepare a solução de trabalho da laminina (1x) diluindo 50x estoque (1 mg / mL) em 1x PBS.
- Aplique 100 μL de 20 μg/mL de laminina em PBS no centro de cada lamínula e evite espalhar a solução para as bordas.
- Incubar as placas a 37 °C numa incubadora humidificada durante 2-6 h. Evitar a secagem da solução de laminina.
- RGCs de dissecção e plaqueamento de embriões
- Preparar e rotular quatro placas de cultura de tecidos de 35 mm e encher com 4 ml de: etanol a 70%, "E2 meio 1", "E2 meio 2", "E2 meio 3" no dia da dissecção. Mantenha os pratos na geladeira até as dissecações.
- Quando os embriões de peixe-zebra estiverem 34 horas após a fertilização (hpf), retire as placas de cultura revestidas com laminina da incubadora e lave as lamínulas três vezes com 0,5 mL de 1x PBS.
- Após a lavagem final, adicione 4 mL de meio ZFCM(+) a cada placa de cultura e evite secar a placa.
- Recupere as placas de cultura preparadas na Etapa 2.2.1. Deixe-os equilibrar para RT.
- Encha 4-6 tubos de PCR com 15 μL de meio ZFCM(+). Um tubo é necessário para preparar RGCs de 4 olhos para serem revestidos em uma lamínula.
- Recupere os embriões de peixe-zebra da incubadora e mergulhe-os em uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 70% de etanol por 5-10 s para esterilizar.
- Usando uma pipeta de transferência, transfira os embriões para o prato E2 Media 1 contendo meio E2 estéril para lavar o excesso de etanol.
- Transfira os embriões para o prato E2 Media 2 e remova seus córions com uma pinça afiada.
- Transfira os embriões para a placa final E2 Media 3 para realizar dissecações.
- Usando um par de pinças finas, disseque as retinas.
- Posicione e segure os embriões anteriormente à gema com uma das pinças e remova a cauda posterior ao saco vitelino com a outra pinça.
- Agarre o pescoço com uma pinça e tire a cabeça para expor o cérebro e os olhos à mídia E2. Evite cortar o saco vitelino.
- Com a ponta de uma pinça fina, role suavemente os olhos para longe da cabeça, enquanto segura o tecido craniano com a segunda pinça. Mantenha os olhos isolados dos detritos de tecido adjacentes.
- Transfira quatro olhos para um dos tubos previamente preparados contendo ZFCM(+).
- Titule suavemente para cima e para baixo com a pipeta P20 e uma ponta amarela cerca de 45 vezes para dissociar as células. Evite bolhas de ar.
- Transfira o ZFCM(+) com células dissociadas para o centro da lamínula. Repita as etapas 10 a 12 para lamínulas adicionais.
- Mantenha as culturas em bancada a 22 °C em um suporte de espuma de poliestireno para absorver as vibrações.
- Realize imagens 6-24 h após o revestimento.
