Aprovações éticas foram obtidas durante a realização dos experimentos.
1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMNCs)
- Certifique-se de que todos os doadores assinaram o consentimento informado antes da retirada de sangue, de acordo com as diretrizes institucionais.
- Retire 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.
- Isole PBMNCs por meio de gradiente de densidade. Use 10 mL de meio com 25 mL de sangue 1:1 diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugue a 300 x g por 30 min.
- Isole a camada interfásica entre o plasma e o meio de gradiente de densidade por pipetagem. Lave as células isoladas com 5 mL de PBS estéril e centrifugue a 300 x g por 10 min. Repita duas vezes.
- Conte o número de células por métodos padrão usando uma câmara de contagem.
2. Ativação da glicoproteína ancorada em glicosilfosfatidilinositol humano (GPI) por reticulação de anticorpos na superfície de PBMNCs
- Coloque as células mononucleares (MNCs) 6 x 106 em tubos de 15 mL e realize a reticulação de anticorpos incubando as células com anticorpo específico da proteína de membrana ligada à GPI humana (30 μg / mL) por 30 min em PBS com albumina de soro bovino (BSA) a 1% a 37 ° C.
- Substitua o meio de incubação pelo meio de Dulbecco modificado de Iscove suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Cultive as células em tubos de poliestireno de 15 mL, coloque os tubos em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 8 a 10 dias (sem agitar). No dia 5 (D5), adicione mais 1-2 mL de meio de Iscove suplementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.
3. Classificação de células desdiferenciadas recém-geradas
- Conte as células com um contador de células automatizado (suspensão de células de 18 μL + corante de fluorescência de 2 μL) ou em uma câmara de contagem.
- Centrifugar a suspensão de células cultivadas (5-7 x 106) a 300 x g durante 10 min e aspirar o sobrenadante resultante com uma pipeta de Pasteur estéril.
- Ressuspenda o pellet celular em 90 μL de PBS pré-resfriado pH 7,2, 0,5% BSA e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM.
- Adicione esferas magnéticas de tamanho nanométrico CD45 positivo (80 μL) à suspensão celular e incube em gelo por 15 min.
- Lave as células adicionando 2 mL de tampão PBS e centrifugue a 300 x g por 10 min.
- Ressuspenda as células em 500 μL de tampão PBS.
- Lave a coluna com 500 μL de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.
- Colocar a suspensão de células na coluna e lavá-la com 500 μL de tampão PBS (duas vezes) e o fluxo da centrífuga contendo células CD45 negativas. Colete-os no meio de Iscove suplementado com 1% de BSA.
- Conte as células na câmara de contagem.
4. Preparação de placas de cultura de células para diferenciação neuronal de células-tronco recém-geradas
- Cubra os vasos de cultura com poli-L-ornitina e laminina para o crescimento de células neuronais.
- Coloque as lamínulas de vidro em placas de 4 poços e cubra-as com poli-L-ornitina diluída 1:5 (0,1 mg/mL em água bidestilada [ddH2O]) em ddH2O. Coloque as lamínulas em uma incubadora a 37 °C por 1 h. Em seguida, lave com ddH2O.
- Descongele lentamente a laminina (0,5-2,0 mg / mL) e adicione ao topo das lamínulas. Incubar a 37 °C durante 2 h.
- Prepare o meio de indução neural N2 consistindo em 49 mL de meio Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (D-MEM/F12), 500 μL de suplemento de N2, 400 μL de aminoácidos não essenciais (NEAA), solução básica de fator de crescimento de fibroblastos (FGF) na concentração final de 20 ng/mL (preparada a partir de 100 μg/mL de solução estoque) e heparina na concentração final de 2 ng/mL.
- Remova o excesso de laminina pipetando e adicione N2 do meio neuronal às placas de cultura.
5. Cultura de células sanguíneas neuronais desdiferenciadas
- Cultura de células CD45 negativas derivadas de BD em lamínulas de vidro revestidas com laminina/ornitina por 2 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 em meio N2 para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD.
- Células de cultura em meio de diferenciação neuronal consistindo em 48 mL de meio neurobasal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de suplemento B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de fator neurotrófico derivado da glia humana recombinante (GDNF) a 5 μg/250 μL em PBS/0,1% BSA e 50 μL de fator neurotrófico derivado do cérebro humano recombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL em PBS/0,1% BSA e 50 μL de solução de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL em PBS. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
