1. Captação de nanopartículas magnéticas celulares (MNP)
- Prepare o meio de crescimento básico para cultura de células PC12 adicionando 10% de soro de cavalo (HS), 5% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio do Roswell Park Medical Institute (RPMI) e filtre usando um filtro de náilon de 0,22 μm.
- Adicione 1% de soro de cavalo (HS), 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio RPMI para preparar o meio de diferenciação PC12 e filtre usando um filtro de náilon de 0,22 μm.
- Cultivar células num balão de cultura não tratado com 10 ml de meio de crescimento básico; adicionar 10 ml de meio de cultura básico ao balão de 2 em 2 a 3 dias e subcultivar as células após 8 dias.
- Para a absorção celular, centrifugue a suspensão celular em um tubo de centrífuga por 8 min a 200 × g e temperatura ambiente, e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em 3 mL de meio de crescimento básico fresco. Centrifugue novamente a suspensão da célula durante 5 min a 200 × g e à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante. Ressuspenda as células em 3 mL de meio de diferenciação fresco.
- Aspire as células 10x usando uma seringa e uma agulha para quebrar os aglomerados de células. Conte as células usando um hemocitômetro e semeie 106 células em um prato regular não revestido de 35 mm.
- Adicione ao prato o volume calculado da suspensão de MNP e o volume do meio de diferenciação para atingir a concentração de MNP e o volume total desejados. Misture as células, MNPs e meio de diferenciação; incubar o prato em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C por 24 h.
- Centrifugar a suspensão da célula durante 5 min a 200 × g à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de diferenciação fresco e conte as células usando um hemocitômetro.
2. Diferenciação e crescimento celular em plataforma magnética
- Limpar o substrato estampado com etanol a 70 % v/v/e colocar o substrato numa placa de cultura de 35 mm na coifa. Coloque um ímã grande (~ 1500 Oersted) abaixo do substrato padronizado por 1 min e remova o ímã movendo primeiro o prato para cima e para longe do ímã e, em seguida, retire o ímã do capô. Ligue a luz ultravioleta por 15 min.
- Cubra o substrato com colágeno tipo 1 diluindo o colágeno tipo 1 (solução de cauda de rato) 1:50 em etanol a 30% v / v. Para revestir uma placa de 35 mm, adicione 20 μL de colágeno a 1 mL de etanol a 30%.
- Cubra o prato com a solução e espere até que toda a solução evapore, deixando o prato descoberto por algumas horas. Lave 3x em estéril 1x PBS; A lâmina de vidro está pronta para semeadura celular.
- Suspenda as células após a captação do MNP celular, semeie 105 células em uma placa de cultura de 35 mm e adicione 2 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em uma incubadora umidificada a 5% de CO2 a 37 °C.
- Após 24 h, adicione 1:100 β-NGF murino fresco (concentração final de 50 ng/mL). Renovar o meio de diferenciação e adicionar β-NGF murino fresco de 2 em 2 dias.
