1. Preparação de placas revestidas com matriz de membrana basal qualificadas para células-tronco embrionárias humanas (hESC)
- Descongele lentamente a solução de matriz de membrana basal qualificada para hESC (consulte a Tabela de Materiais) a 4 ° C por pelo menos 2–3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel.
- Para preparar placas revestidas com matriz de membrana basal, dilua a matriz em meio Eagle modificado de Dulbecco frio com F12 (DMEM+F12) até uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da solução de matriz diluída.
- Incubar as placas revestidas com matriz da membrana basal à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 3 h ou a 4 °C durante a noite.
nota: As placas com matriz de membrana basal podem ser armazenadas a 4 °C por 1 semana antes que a solução da matriz seja removida e as placas sejam usadas.
2. Adaptação de hESCs do tipo colônia à cultura de hESC de célula única
- Para passar as culturas livres de alimentador de hESCs do tipo de colônia H9 (WA09) cultivadas na matriz da membrana basal, aspire o meio dos poços ( Figura 1A ).
- Lave 1x com 1 mL de DPBS. Adicionar 1 ml de solução de dispase (1 U/ml) por alvéolo e incubar a 37 °C durante 20 min.
- Remova o dispase, lave as células 1x suavemente com 2 mL de DMEM/F12, remova o meio e adicione 2 mL de DMEM/F12 a cada placa.
- Separe suavemente as colônias pipetando suavemente para cima e para baixo e transfira para um tubo de 15 mL.
- Centrifugue os pellets por 2 min a 370 x g e aspire o meio.
- Para dissociar os grânulos celulares em células únicas, adicione 2 mL de solução de descolamento celular (concentração 1x, consulte a Tabela de Materiais) e incube a 37 ° C por 10 min.
- Centrifugue as células por 2 min a 370 x g e remova a solução de descolamento.
- Adicione o meio ESC humano mTeSR1 fresco e dissocie as células em células individuais pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Para adaptar as hESCs do tipo colônia a uma cultura do tipo célula única, coloque aproximadamente 1,5–2,0 x 106 hESCs em cada poço da placa de 6 poços revestida com matriz da membrana basal em 2 mL de mTeSR1 contendo 10 μM de inibidor de ROCK por 24 h (Figura 1A).
- Após 24 h, substitua o meio hESC por mTeSR1 fresco sem inibidor de ROCK e deixe as hESCs crescerem como um tipo de célula única por 3 dias. Mude o meio diariamente.
- No dia 4, quando as culturas atingirem quase 100% de confluência, dissocie as células em solução de descolamento e, em seguida, replaquee conforme descrito na etapa 2.6.
nota: O inibidor de ROCK melhora a sobrevivência celular durante as 24 h iniciais da cultura de hESC do tipo célula única.
3. Diferenciação de hESCs do tipo célula única em NPCs (Figura 2)
- Para induzir a diferenciação de NPC, dissocie hESCs do tipo célula única com 1 mL de solução de descolamento (1x) e incube por 10 min a 37 ° C.
- Centrifugue as células por 2 min a 370 x g e remova o sobrenadante da solução de descolamento. Adicione 1 mL de DMEM / F12 e ressuspenda as células por pipetagem suave.
- Células da placa em uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal a uma densidade de 2 x 105 células/poço em 2 mL de mTeSR1 contendo 10 μM de inibidor de ROCK.
- Após 24 h, substitua o meio de cultura por um meio de indução neural (DMEM com 1% de B27 menos vitamina A) suplementado com 1 μM de dorsomorfina e 5 μM de SB431542.
- Mude o meio a cada dois dias durante os primeiros 4 dias de indução neural, depois todos os dias até atingir a confluência no dia 7 (Figura 2B).
NOTA: (1) A dorsomorfina inibe a via BMP visando os receptores ALK2,3,6 e também inibe a AMPK; SB431542 é um inibidor da via TGFβ / Activina, visando ALK5,7. (2) O mesmo protocolo foi testado com outra linhagem ESC (WA01), que apresentou resultados semelhantes aos WA09. (3) geralmente usamos Matrigel para a matriz da membrana basal; no entanto, as células podem ser cultivadas em Geltrex e depois diferenciadas em NPCs com resultados muito semelhantes, conforme indicado pela expressão de vários marcadores NPC (Figura 3D, E). Manuseie Geltrex da mesma maneira que Matrigel (consulte a seção 1).
