Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Esterilização de materiais
NOTA: Todos os materiais e soluções devem ser esterilizados antes do uso.
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas e material de corte de vibratomo (porta-faca, disco de amostra, bandeja tampão) em um forno de esterilização a seco por 4 h a 180 ° C.
- Esterilize materiais ou equipamentos sensíveis à temperatura por irradiação UV ou gama.
- Esterilize meios e soluções por autoclave ou filtração através de membranas de poros de 0,22 μm.
2. Preparação das soluções
- Preparar 15-20 mL de solução de transporte: solução salina balanceada de Hanks (HBSS) a 50% v/v pH 7,4, meio basal a 50% v/v para manutenção de neurônios cerebrais pós-natais e adultos (Tabela de Materiais), suplementada com 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 3 mg/mL de glicose e 33 μg/mL de gentamicina.
nota: A solução de transporte deve ser refrigerada e oxigenada (borbulhando com gás carbógeno) por pelo menos 20 minutos antes da coleta da amostra.
- Prepare 300 mL de solução de fatiamento (HBSS suplementado com HEPES 10 mM e 3 mg / mL de glicose) e resfrie em um freezer até o ponto de formação inicial de cristais.
- Prepare 20 mL de meio de cultura: meio basal para manutenção de neurônios cerebrais pós-natais e adultos (Tabela de Materiais) suplementado com 1% de derivado de L-glutamina (Tabela de Materiais), suplemento de 2% para cultura neural (Tabela de Materiais), 1% de penicilina/estreptomicina e 0,25 μg/mL de anfotericina B.
3. Configurando o aparelho de fatiamento
NOTA: Este protocolo é idealmente realizado com o auxílio de um colega devido à logística de coleta de amostras na sala cirúrgica.
- Em um balde de gelo adicionado de sal, deixe a solução de fatiar descansar sob a mistura de carbogênio borbulhando (95% O2, 5% CO2) por pelo menos 20 min antes de usar.
- Prepare um bloco de agarose a 3% (aproximadamente 2 cm x 2 cm x 2 cm) e cole-o no disco da amostra de vibratomo para criar suporte mecânico adicional para a amostra de tecido durante o corte (Figura 1E).
- Defina o vibratomo para fatiar: espessura da seção de 200 μm, frequência de vibração de 100 Hz e velocidade de corte entre 0.5-1.0 mm/s.
- Trave a bandeja tampão do vibratome na base do vibratome e adicione gelo para mantê-la refrigerada antes de receber a solução de fatiamento e a amostra, e durante todo o procedimento de fatiamento.
4. Coleta de amostra
NOTA: Neste protocolo, o tecido neocortical humano foi coletado na sala cirúrgica e transportado para o laboratório.
CUIDADO: Ao lidar com amostras humanas, siga os protocolos de segurança apropriados estabelecidos pela Instituição.
- Montar o aparelho de transporte (figura 1C) que consiste em: um cilindro de gás portátil com mistura de carbógeno ligado a uma válvula de pressão/fluxo que controla a saída de gás ligada a uma tubagem de silício que liga a saída de gás ao recipiente de transporte; um recipiente de transporte, geralmente um tubo de centrífuga cónico de 50 ml com tampa perfurada para entrada de gás, contendo a solução de transporte; e gelo para resfriamento da amostra durante o transporte.
- Colete e transporte a amostra (Figura 1B) imediatamente para o laboratório. Mergulhe a amostra em solução de transporte a frio (constantemente borbulhada com mistura de carboidratos).
5. Fatiamento
- Transferir a amostra para uma placa de Petri (100 mm x 20 mm) contendo solução de corte e, com ferramentas cirúrgicas finas, remover cuidadosamente o máximo possível das meninges restantes na amostra (Figura 1D).
- Escolha a melhor orientação do corpo de prova para produzir fatias com as características particulares do projeto experimental e, com uma lâmina de bisturi nº 24, apare uma superfície plana para ser a base colada ao disco do corpo de prova.
- Usando uma colher de plástico descartável e pincéis delicados, colete o fragmento da placa de Petri e seque o excesso de solução usando papel de filtro (seque por capilaridade e evite tocar no fragmento de tecido com papel).
- Usando supercola, prenda o tecido ao disco da amostra de vibratomo até que esteja firmemente aderido ao disco e em contato com o bloco de agarose (Figura 1E).
- Coloque o disco de amostra do vibratome (com o tecido devidamente fixado) na bandeja tampão do vibratome preenchida com a solução de corte que deve estar borbulhando durante todo o processo.
- Trave o porta-faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada.
- A solução de corte deve cobrir tanto a amostra como a lâmina, só depois começar a cortar (Figura 1F).
- Corte a amostra em fatias de 200 μm.
nota: Embora alguns vibratomos cortem as amostras automaticamente, a observação atenta e pequenos ajustes na velocidade de corte durante o processo podem ajudar a produzir fatias melhores. Descarte as fatias irregulares iniciais.
- Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri com solução de corte e apare as bordas soltas e o excesso de matéria branca para uma proporção de cerca de 70% de córtex / 30% de substância branca.
6. Cultura
NOTA: Execute esta etapa em um gabinete de fluxo laminar em ambiente estéril.
- Adicionar 600 μL de meio de cultura por alvéolo (numa placa de 24 poços) e incubar durante pelo menos 20 min a 36 °C e 5% de CO2 antes de plaquear as fatias.
- Coloque uma fatia por poço usando um pincel (Figura 1G).
- Se houver poços não utilizados na placa, encha-os com 400 μL de água estéril.
- Incubar a placa a 36 °C, 5% CO2.
nota: A primeira substituição do meio deve ser feita entre 8-16 h após o revestimento, dependendo do tamanho da fatia.
- Suplemente 10 mL do meio de cultura previamente preparado com 50 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
nota: Durante as primeiras 8-16 h, as fatias são incubadas em 600 μL de meio para evitar a privação de nutrientes e acidificação, uma vez que o consumo do meio nesta fase é acelerado. A partir da próxima etapa, o volume de meio por poço é ajustado para 400 μL.
- Remova 333 μL do meio condicionado de cada poço e adicione 133 μL de meio fresco suplementado com BDNF.
- Repita o processo de substituição do meio a cada 24 h, substituindo um terço do meio condicionado por meio fresco suplementado com BDNF.
