Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

Resumo

Fonte: Collins, H. Y., et al., Isolamento e cultura de micróglia de roedores para promover uma morfologia dinâmica ramificada em meio sem soro. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um método para isolar e cultivar microglia de cérebros de ratos. Envolve a separação da microglia de outras células neuronais e não neuronais usando placas revestidas com um anticorpo monoclonal específico para a microglia.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Prepare uma placa de Petri para imunopanning CD11b (Dia 0)

NOTA: Prepare 1 placa de imunopanning para cada 1 - 2 cérebros de ratos juvenis.

1. Adicione 25 mL de solução de Tris pH 9,5 50 mM a uma placa de Petri de 15 cm.
2. Adicione IgG anti-rato de cabra (cadeias H + L) ao prato para uma concentração final de 6 μg / mL. Placa de giro para distribuir uniformemente.
3. Incubar a cápsula durante 1 - 3 h a 37 °C.
4. Lave a louça três vezes com DPBS++ (solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Ca²⁺ e Mg²⁺) e substitua por uma solução de tampão panorâmico contendo 1 μg / mL de anticorpo OX42. Deixe a louça durante a noite em temperatura ambiente em uma superfície plana.

2. Coleta de tecido (dia 1)

NOTA: Este protocolo deve levar ~3 - 4 h.

1. Antes de começar, certifique-se de que todas as soluções sejam estéreis e refrigeradas com gelo. Resfrie todos os instrumentos no gelo e esterilize com etanol antes de usar.
2. Seguindo os procedimentos regulatórios apropriados, sacrifique um rato de laboratório juvenil por asfixia por dióxido de carbono.
   nota: Alternativamente, os animais mais jovens podem ser sacrificados com uma dose letal de cetamina / xilazina (100 - 200 μL de 24 mg / mL de cetamina, 2,4 mg / mL de xilazina). A cetamina/xilazina deve ser utilizada se os animais tiverem menos de 14 dias de idade. Se estiver usando vários animais, extraia o tecido de um animal e coloque-o em DPBS⁺⁺ pré-resfriado no gelo antes de prosseguir para os animais subsequentes.
3. Aperte uma pata traseira e certifique-se de que o animal não responda completamente antes de prosseguir.
4. Perfundir transcardialmente o animal com 10 a 30 mL de tampão de perfusão gelada usando uma agulha 271/2-G até que o tampão fique limpo.
   nota: O volume do tampão de perfusão varia de acordo com o tamanho/idade do animal.
5. Imediatamente após a perfusão, remova a cabeça do animal. Vindo da medula espinhal, corte o côndilo occipital de cada lado com uma tesoura de dissecação, tome cuidado para não danificar o cérebro. Depois de cortar cada lado com cuidado, corte um lado ao longo do osso parietal e frontal em direção ao osso nasal. Com uma pinça, puxe cuidadosamente a parte superior do crânio, remova rapidamente o cérebro (ou estruturas de interesse do SNC) e coloque em DPBS ⁺⁺ pré-resfriado no gelo.
6. Repita para todos os animais restantes.
   nota: Todas as etapas do processo devem ser realizadas em uma capela de fluxo laminar sob condições estéreis adequadas.

3. Dissociação Mecânica (Dia 1)

1. Depois que todos os cérebros forem coletados, corte um cérebro em pedaços de 1 mm^{e 3} em uma placa de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi fria e transfira para um homogeneizador de gotejamento gelado com 5 a 7 mL de tampão de dobramento gelado. Dissocie um cérebro de cada vez.
2. Dissocie o tecido usando 10 a 20 movimentos suaves e incompletos com um homogeneizador dounce solto. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogeneizador, mas em vez disso, impulsione o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogeneizador.
3. Remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permita que pedaços de tecido mal dissociados se depositem no fundo do homogeneizador e transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico resfriado de 50 mL.
4. Substitua o volume removido por um tampão de duplicação novo e repita as etapas 3.2 e 3.3 por um total de 3 a 4 rodadas ou até que todo o tecido tenha sido dissociado. Repita o procedimento para cada cérebro.

4. Remoção de mielina (dia 1)

NOTA: A remoção de mielina é usada para isolamento de micróglia de animais com mais de P12.

1. Meça o volume da suspensão celular no tubo cônico de 50 mL usando uma pipeta de 25 mL e, em seguida, adicione tampão de duchas gelado para ajustar o volume total para 33,5 mL.
2. Adicione 10 mL de tampão de separação de mielina (MSB) à suspensão celular e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mL.
3. Centrifugue as células por 15 min a 500 x g a 4 °C com frenagem lenta.
   nota: A centrífuga deve levar aproximadamente 1,5 a 2 minutos para desacelerar. Isso gerará uma camada superior de mielina e detritos de células mortas, um sobrenadante um tanto obscuro e um pellet menor que é enriquecido para células vivas.
4. Remova a camada superior de mielina / detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir que o máximo possível seja removido.
5. Ressuspenda o pellet celular em 12 mL de tampão panorâmico. Triture suavemente a suspensão celular para quebrar quaisquer aglomerados de células que possam permanecer.

5. Imunopanning (Dia 1)

1. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm para remover grandes detritos ou aglomerados de células.
2. Enxágue o prato panorâmico revestido com OX42 três vezes com DPBS++. Não deixe a placa secar completamente entre as lavagens.
3. Despeje a última lavagem DPBS ++ e aplique a suspensão de células filtradas no prato panorâmico. Gire suavemente a placa para distribuir as células e, em seguida, incube a placa em uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que as células adiram. Não incube por mais de 20 minutos ou as células se tornarão muito difíceis de recuperar do prato.
4. Enxágue o prato panorâmico com DPBS++ 10 vezes para remover as células não aderentes. A microglia ficará firmemente presa à placa, portanto, gire a placa a cada enxágue para garantir a remoção de outras células não aderentes.
5. Despeje a última lavagem do DPBS⁺⁺ e substitua por 15 mL de DPBS++ e 200 μL de tripsina (solução estoque a 1,25%).
6. Incubar o prato por ≤10 min a 37 °C com 10% de CO₂ para tripsinizar.
   nota: Não continue por mais de 10 minutos ou a microglia se tornará difícil de remover.
7. Após 10 minutos de tripsinização, a microglia ainda estará presa à placa. Despeje a tripsina / DPBS ⁺⁺ e lave suavemente 2x com DPBS ⁺⁺ para remover a tripsina, substitua por 12 mL de meio de crescimento de microglia (MGM) gelado.
8. Coloque o prato panorâmico no gelo por 2 min para ajudar a enfraquecer a interação célula / substrato e certifique-se de que o prato esteja plano para evitar que as áreas do prato sequem.
9. Pipete vigorosamente com uma pipeta de 10 mL e um controlador de pipeta em alta velocidade para recuperar as células do prato panorâmico. Desenhe uma grade de 16 x 16 com o fluxo de líquido da pipeta para tentar remover todas as células.
10. Verifique as células ao microscópio com ampliação de 20X para garantir que as células se desprenderam da placa. Marque os pontos no topo do prato onde as células ainda estão presas e repita a pipetagem nessas áreas.
11. Colete a suspensão celular e alíquota de 3 a 4 mL de sobrenadante por tubo cônico de 15 mL. Gire por 15 min a 500 x g a 4 °C com frenagem lenta.
    nota: A microglia giratória através de um pequeno volume permite a recuperação máxima das células.
12. Aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mL de MGM com o pellet celular.
13. Ressuspenda cada pellet no MGM restante e agrupe as células de todos os tubos.
14. Conte as células com hemocitômetro.
15. Células da placa conforme descrito nas etapas 6 a 7, dependendo da aplicação.
16. Células de cultura a 37 °C com 10% de CO₂,
    nota: As células podem ser cultivadas por até 3 a 4 semanas com alterações regulares de meio ou uma semana sem alterações de meio.

6. Revestimento Pontual de Placas/Lamínulas de Cultura de Tecidos (Dia 1)

1. Placa de 15 μL de revestimento de colágeno IV diretamente no centro de uma placa de cultura de tecidos com revestimento aniônico/catiônico de 24 poços (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) e incube por 15 min a 37 °C com 10% de CO₂.
2. Após a contagem de células com hemocitômetro, dilua as células para 2,3 x 10⁵ / mL em MGM. Aspire o ponto IV de colágeno e coloque imediatamente 15 μL de suspensão celular neste local; Isso dará 3,5 x 10³ células/ponto. Incube por 5 a 10 min a 37 ° C com 10% de CO₂ para permitir que as células adiram, adicione 500 μL de meio de crescimento (TIC) contendo TGF-β2 / IL-34 / colesterol equilibrado com CO₂ suavemente ao poço.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão de duplicação			Receita: 200 μL de DNaseI a 0,4% em 50 mL de DPBS++ Comentários: Use quando gelado
Buffer de movimento panorâmico			Receita: 2 mg/mL de peptona de sólidos do leite em DPBS++
Meio de crescimento da microglia (MGM)			Receita: DMEM/F12 contendo 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μg/mL de N-acetilcisteína, 5 μg/mL de insulina, 100 μg/mL de apotransferrina e 100 ng/mL de selenito de sódio Comentários: Use MGM gelado para tirar a microglia do prato de immnopanning.
Revestimento de colágeno IV			Receita: MGM contendo 2 μg/mL de colágeno IV
Tampão de separação de mielina			Receita: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sem Ca++ e Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comentários: Misture bem após a adição de CaCl2 e MgCl2
tripsina	sigma	T9935
DMEM/F12	Gibco	Rolamento 21041-02
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122
DMEM (glicose alta)	Gibco	11960-044
Colágeno IV			Reconstituição: 200 μg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:100 Armazenamento: -80 ° C
camundongo anti-rato CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	MCA275R	Panning: 1:1.000; Coloração: 1:500
TGF-b2/IL-34/Meios de crescimento contendo colesterol (TIC)			Receita: MGM contendo 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 μg/mL de colesterol de lã ovina, 10 μg/mL de sulfato de heparano, 0,1 μg/ml de ácido oleico e 0,001 μg/ml de ácido gondóico Comentários: Certifique-se de adicionar colesterol ao meio aquecido a 37 ° C e não adicione mais de 1,5 μg / mL ou ele precipitará. Não filtre meios que contenham colesterol. Equilibre o meio TIC com 10% de CO2 por 30 min- 1 hora antes de adicionar às células para garantir o pH ideal.
Percoll PLUS	GE Saúde	Gato # 17-5445-02
Placas Primaria	VWR	Gato # 62406-456
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS