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Preparação de seções cerebrais usando um método de recuperação protetora baseado em NMDG

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Ting, J. T. et al. Preparação de fatias cerebrais agudas usando um método otimizado de recuperação protetora de N-metil-D-glucamina. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve um protocolo para obter fatias de cérebro usando um método de recuperação protetora baseado em N-metil-D-glucamina (NMDG). Um cérebro dissecado é incubado em um aCSF com NMDG e HEPES para minimizar a morte e os danos das células neuronais durante a secção. A seção pode se recuperar no aCSF para restaurar as atividades celulares

Protocolo

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1. Dissecção e corte do cérebro

  1. Decapite o animal. Use um bisturi para abrir a pele da cabeça e expor a calota craniana.
  2. Use uma tesoura fina supercortada para cortar a pele sobre a calota craniana e faça pequenas incisões lateralmente em ambos os lados na base caudal / ventral do crânio. Faça cortes superficiais adicionais começando no aspecto caudal / dorsal do crânio, movendo-se na direção rostral até a linha média dorsal, tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente. Faça um corte final em 'T' perpendicular à linha média ao nível dos bulbos olfatórios.
    nota: Deve-se tomar cuidado para garantir que nenhum dano seja causado à(s) região(ões) do cérebro de interesse. Em particular, em nenhum momento deve haver qualquer força compressiva aplicada ao próprio cérebro.
  3. Use a pinça de ponta redonda para agarrar o crânio, começando no aspecto rostral-medial e descasque de volta para a direção caudal-lateral. Repita para ambos os lados para abrir e remover as metades dorsais da calota craniana para expor o cérebro. Retire suavemente o cérebro intacto no béquer de NMDG-HEPES aCSF pré-resfriado. Deixe o cérebro esfriar uniformemente por ~ 1 min.
  4. Utilizar a espátula grande para retirar o cérebro do copo e colocá-lo na placa de Petri coberta com papel de filtro. Apare e bloqueie o cérebro de acordo com o ângulo preferido de corte e a região cerebral desejada de interesse. Trabalhe rapidamente para evitar a privação prolongada de oxigênio durante o manuseio.
    nota: Muitos ângulos de corte são possíveis. O método exato de bloqueio e o ângulo de corte dependerão da região exata do cérebro, do tipo de célula e do circuito a ser estudado.
  5. Fixe o bloco cerebral no suporte da amostra usando cola adesiva. Retraia a peça interna do suporte da amostra o suficiente para retirar o bloco cerebral totalmente para dentro. Despeje a agarose derretida diretamente no suporte até que o bloco cerebral esteja totalmente coberto de agarose. Prenda o bloco de resfriamento de acessórios pré-resfriado ao redor do suporte da amostra por ~10 s até que a agarose solidifique.
  6. Insira o porta-amostras no receptáculo da máquina fatiadora e verifique o alinhamento adequado. Encha o reservatório com NMDG-HEPES aCSF oxigenado e pré-resfriado restante do béquer de 250 mL e mova uma pedra de bolha para dentro do reservatório durante o corte para garantir a oxigenação adequada.
  7. Ajuste o micrômetro para começar a avançar a amostra cerebral embebida em agarose. Inicie o fatiador e ajuste empiricamente a velocidade de avanço e a frequência de oscilação para o nível desejado.
    nota: Ambas as configurações devem estar na faixa baixa. Para obter melhores resultados, uma única passagem do braço da lâmina deve levar aproximadamente 20 s e a oscilação deve produzir um zumbido muito suave e suave, sem zumbido evidente.
  8. Continue avançando e cortando o tecido em incrementos de 300 μm (ou outra espessura preferida) até que a região do cérebro de interesse esteja totalmente seccionada; o tempo total para o procedimento de fatiamento deve ser inferior a 15 min.

2. Procedimento de recuperação protetora NMDG otimizado

  1. Etapa inicial de recuperação do NMDG (etapa crítica): Após a conclusão do procedimento de seccionamento, colete todas as fatias usando uma pipeta de plástico Pasteur cortada e transfira-as para uma câmara de recuperação inicial pré-aquecida (34 ° C) preenchida com 150 mL de NMDG-HEPES aCSF. Transfira todas as fatias em curta sucessão e inicie um cronômetro assim que todas as fatias forem movidas para a câmara de recuperação.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Compresstome VF-200Instrumentos de precisãoVF-200Fatiador de tecido vibratório (recomendado)
N-metil-D-glucaminaSigma AldrichM2004Constituinte do aCSF
cloreto de sódioSigma AldrichS3014Constituinte do aCSF
Cloreto de potássioSigma AldrichPág. 5405Constituinte do aCSF
Fosfato de sódio monobásico di-hidratadoSigma AldrichRolamento 71505Constituinte do aCSF
bicarbonato de sódioSigma AldrichS5761Constituinte do aCSF
HEPESSigma AldrichH4034Constituinte do aCSF
glicoseSigma AldrichG7021Constituinte do aCSF
Ascorbato de sódioSigma AldrichRolamento A4034Constituinte do aCSF
TioureiaSigma AldrichT8656Constituinte do aCSF
Piruvato de sódioSigma AldrichPág. 5280Constituinte do aCSF
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma AldrichC7902Constituinte do aCSF
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigma AldrichM1880Constituinte do aCSF
Pinça curva rombaFerramentas de Belas Ciências11065-07Ferramentas de dissecção cerebral
Tesoura de dissecação fina (supercut)Ferramentas de Belas Ciências14058-09Ferramentas de dissecção cerebral
Tesoura grande e resistente 7 ''Ferramentas de Belas Ciências14000-18Ferramentas de dissecção cerebral
Espátula metálicaSigma AldrichZ511455-1PAKFerramentas de dissecção cerebral
LâminasVWR89031-954Ferramentas de dissecção cerebral
Guardião da Fatia do Cérebro-4Automatize o ScientificS-BSK4câmara de retenção de fatia de cérebro
rede de nylonWarner InstrumentsNº 64-0198Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias
Copos de vidro Pyrex (250 mL)VWRRolamento 89090-434Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias
Prato de plástico de 35 mm, redondoVWRRolamento 100488-376Para a construção de câmaras de recuperação de pequenas fatias
Pedras difusoras de gás (10 μm)Sigma AldrichRolamento 59277Para carbogenação constante (bolhas finas)
Agarose Tipo I-BSigma AldrichRolamento A0576Para incorporar amostras cerebrais
ácido clorídricoSigma AldrichH1758-100MLPara ajuste de pH do meio
hidróxido de sódioSigma Aldrich221465-25GPara ajuste de pH do meio
Hidróxido de potássioSigma Aldrich221473Para ajuste de pH do meio
Pipetas de transferência de plástico 3 mL graduadasVWRRolamento 89497-676Para transferência de fatias
Lâminas injetoras de cerâmica de zircônioLâminas especiais CadenceEF-INZ10http://cadenceinc.com/
Banho-maria aquecido (2,5L)VWR13491-060variado
Círculos de papel de filtroVWRRolamento 28456-022variado
Cola de cianoacrilatoamazonaB000BQRBO6variado
Placa de Petri de vidroVWR89000-326variado
10X solução salina tamponada com fosfatoSigma AldrichPág. 5493variado
Termomisturador (com bloco de tubo de 1,5 mL)VWR89232-908Para manter a agarose derretida

Reimpressões e permissões

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Etiquetas

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

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