1. Dissecção e corte do cérebro
- Decapite o animal. Use um bisturi para abrir a pele da cabeça e expor a calota craniana.
- Use uma tesoura fina supercortada para cortar a pele sobre a calota craniana e faça pequenas incisões lateralmente em ambos os lados na base caudal / ventral do crânio. Faça cortes superficiais adicionais começando no aspecto caudal / dorsal do crânio, movendo-se na direção rostral até a linha média dorsal, tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente. Faça um corte final em 'T' perpendicular à linha média ao nível dos bulbos olfatórios.
nota: Deve-se tomar cuidado para garantir que nenhum dano seja causado à(s) região(ões) do cérebro de interesse. Em particular, em nenhum momento deve haver qualquer força compressiva aplicada ao próprio cérebro.
- Use a pinça de ponta redonda para agarrar o crânio, começando no aspecto rostral-medial e descasque de volta para a direção caudal-lateral. Repita para ambos os lados para abrir e remover as metades dorsais da calota craniana para expor o cérebro. Retire suavemente o cérebro intacto no béquer de NMDG-HEPES aCSF pré-resfriado. Deixe o cérebro esfriar uniformemente por ~ 1 min.
- Utilizar a espátula grande para retirar o cérebro do copo e colocá-lo na placa de Petri coberta com papel de filtro. Apare e bloqueie o cérebro de acordo com o ângulo preferido de corte e a região cerebral desejada de interesse. Trabalhe rapidamente para evitar a privação prolongada de oxigênio durante o manuseio.
nota: Muitos ângulos de corte são possíveis. O método exato de bloqueio e o ângulo de corte dependerão da região exata do cérebro, do tipo de célula e do circuito a ser estudado.
- Fixe o bloco cerebral no suporte da amostra usando cola adesiva. Retraia a peça interna do suporte da amostra o suficiente para retirar o bloco cerebral totalmente para dentro. Despeje a agarose derretida diretamente no suporte até que o bloco cerebral esteja totalmente coberto de agarose. Prenda o bloco de resfriamento de acessórios pré-resfriado ao redor do suporte da amostra por ~10 s até que a agarose solidifique.
- Insira o porta-amostras no receptáculo da máquina fatiadora e verifique o alinhamento adequado. Encha o reservatório com NMDG-HEPES aCSF oxigenado e pré-resfriado restante do béquer de 250 mL e mova uma pedra de bolha para dentro do reservatório durante o corte para garantir a oxigenação adequada.
- Ajuste o micrômetro para começar a avançar a amostra cerebral embebida em agarose. Inicie o fatiador e ajuste empiricamente a velocidade de avanço e a frequência de oscilação para o nível desejado.
nota: Ambas as configurações devem estar na faixa baixa. Para obter melhores resultados, uma única passagem do braço da lâmina deve levar aproximadamente 20 s e a oscilação deve produzir um zumbido muito suave e suave, sem zumbido evidente.
- Continue avançando e cortando o tecido em incrementos de 300 μm (ou outra espessura preferida) até que a região do cérebro de interesse esteja totalmente seccionada; o tempo total para o procedimento de fatiamento deve ser inferior a 15 min.
2. Procedimento de recuperação protetora NMDG otimizado
- Etapa inicial de recuperação do NMDG (etapa crítica): Após a conclusão do procedimento de seccionamento, colete todas as fatias usando uma pipeta de plástico Pasteur cortada e transfira-as para uma câmara de recuperação inicial pré-aquecida (34 ° C) preenchida com 150 mL de NMDG-HEPES aCSF. Transfira todas as fatias em curta sucessão e inicie um cronômetro assim que todas as fatias forem movidas para a câmara de recuperação.
