Uma técnica para a incubação prolongada do tecido neuronal da retina

Resumo

Fonte: Cameron, M. A., et al. Incubação prolongada de tecido neuronal agudo para eletrofisiologia e imagens de cálcio. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um método para incubação prolongada do tecido neuronal da retina. As oculares contendo retina são obtidas de um olho de camundongo; a membrana limitante interna (ILM) é digerida enzimaticamente para expor as células neuronais da retina, e a ocular tratada ou a retina isolada é transferida para uma incubadora especializada para incubação prolongada a baixa temperatura.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação de montagem total da retina e remoção da membrana limitante interna

1. Prepare montagens inteiras de retina sob condições normais de iluminação de laboratório ou luz fraca vermelha / infravermelha.
2. Eutanásia do animal por luxação cervical e imediatamente enuclear os olhos. Faça um pequeno corte ao longo da ora serrata e coloque em meio Ames ou líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) contendo (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glicose, 0,5 L-glutamina e sature com carbogênio (95% O₂/5% CO₂ mistura; ~ 300 mOsm; pH 7,4), à temperatura ambiente (RT).
3. Remova imediatamente a córnea, o cristalino e o vítreo, cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e removendo o cristalino e o vítreo com uma pinça. Colocar o tecido no sistema de incubação em RT.
   nota: O tecido retiniano pode ser mantido na ocular, após uma lenta redução da temperatura para 15 - 16 °C, durante >24 h no sistema de incubação até ser necessário.
4. Para remover o ILM, transfira a ocular contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo 30 U / mL de papaína, 1 mM de L-cistina, 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0,005% de desoxirribonuclease (DNase) em Earl's Balanced Salt Solution (BSS) a 37 ° C por 20 min. Aplique 95% O₂/5% CO₂ na solução através da tampa, mas não borbulhe. Se estiver usando tecido de animais jovens (<6 semanas), dilua a solução até a metade.
   1. Interrompa a digestão enzimática colocando o tecido em uma solução de ovomucóide (10 mg/mL) e albumina de soro bovino (BSA, 10 mg/mL) por 10 min em Earl's BSS. Lave bem o tecido com aCSF antes de transferir para o sistema de incubação e reduza a temperatura para 15 - 16 °C.
5. Mantenha o tecido da retina na ocular até que seja necessário. Para transferência para o microscópio, isole a retina da ocular e corte em 4 pedaços com uma lâmina de barbear. Se toda a retina for necessária, faça quatro pequenos cortes na periferia da retina para permitir que ela fique plana.
   nota: Para experimentos de imagem, carregue com corantes de cálcio antes de transferir para o sistema de incubação, veja abaixo.

2. Manutenção do tecido na incubadora

1. Coloque o tecido na câmara principal contendo sondas para medições de pH e temperatura (Figura 1A, B).
2. Circule o aCSF através de uma segunda câmara (câmara UVC, construída conforme descrito anteriormente) isolada da câmara principal e exposta à luz ultravioleta C (UVC) de 1,1 W (254 nm, lâmpada UV esterilizadora 5W / 2P) para erradicar as bactérias que flutuam na solução ( Figura 1A ). Controle o tempo de luz UVC por meio de um temporizador programável usando um recurso aleatório que liga às vezes variando entre 15 e 26 min a cada 15 - 30 min para evitar o aquecimento excessivo do aCSF.
3. Defina a taxa de fluxo na câmara UVC para 12 mL / min conforme relatado anteriormente. Cubra a câmara UVC com papel alumínio para evitar a iluminação UVC fora da câmara, que pode danificar o tecido neuronal.
   nota: Para tecido retiniano adaptado ao escuro, aplique uma cobertura personalizada na câmara principal para excluir a luz.
4. Use uma bomba peristáltica para circular a solução (aCSF) através das duas câmaras e um resfriador termoelétrico de placas frias Peltier para resfriar ou aquecer a câmara principal até as temperaturas desejadas na faixa de 0 a 50 °C. Para uma incubação ideal do tecido, use 15 - 16 °C para viabilidade a longo prazo.

Resultados

Figura 1. Um sistema de incubação que permite uma regulação rígida do ambiente do tecido. A, diagrama esquemático do sistema de incubação composto por uma placa Peltier de resfriamento, câmara principal, bomba peristáltica e câmara UVC. B, Vista lateral da câmara principal mostrando os pontos de entrada e saída do aCSF, bem como as sondas de entrada, temperatura e pH do carbógeno. O ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
cloreto de sódio	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	Pág. 9333
N-metil-D-glucamina	Sigma Aldrich	M2004
D-glicose	Sigma Aldrich	G5767
bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich	S6014
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M9272
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	223506
Sistema de dissociação de papaína	Worthington	LK003150
Microscópio vertical de platina fixa	Olimpo	BX51WI
Objetiva de microscópio	Olimpo	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Objetiva de microscópio	Olimpo	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
Cubadora de cérebros	Payo Científico	BR26021976	www.braincubator.com.au
Resfriador de placa fria termoelétrico Peltier	Tecnologia TE	CP-121
Controlador de temperatura	Tecnologia TE	TC-36-25 RS232