1. Preparação de Materiais e Meio de Cultura
- Para a dissecção e dissociação da SCZ (zona subcalosa), envolva a matriz cerebral, a lâmina de barbear de dois gumes e a pinça com papel alumínio e, em seguida, esterilize-os em autoclavagem.
- Prepare 50 ml de tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) frio para lavar todo o cérebro do camundongo.
- Montar um microscópio de dissecção e preparar as ferramentas cirúrgicas necessárias para a dissecção do cérebro (tesoura e pinça autoclavadas) e o isolamento da SCZ (seringa de 1 ml, agulha 30 G, matriz cerebral e pinça fina).
- Preparação do meio N2:
- Prepare o meio F-12/DMEM (+L-glutamina, +bicarbonato de sódio) com 2% de B27, 1% de suplementos de N2 e 1% de Penicilina-Estreptomicina.
Nota: O meio de crescimento consiste em meio N2 e fatores de crescimento (fator de crescimento epidérmico purificado de 20 ng/mL (EGF) e fator de crescimento básico de fibroblastos de 20 ng/mL (bFGF2)).
- Prepare um tampão de digestão (40 unidades/ml de papaína, 2,4 unidades/ml de dispase II e 2% de penicilina-estreptomicina em PBS) para a digestão dos tecidos.
- Preparação da placa de revestimento e lamínula:
- Prepare poli-L-ornitina (OLP; 0,01%) e laminina (10 μg/ml dissolvido em DH2O). Para revestir placas de 6 poços para a manutenção de SCZ-aNSCs (células-tronco neurais adultas) como monocamada ou lamínulas de 18 mm para imunocoloração, incube-as com PLO durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH2O. Deixe as placas e lamínulas secarem após a última lavagem.
- Em seguida, incubar as placas com laminina durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH2O.
Cuidado: Não seque a laminina, o que afetará a fixação da célula.
Nota: As soluções de revestimento podem ser reutilizadas 3 vezes.
2. Isolamento e dissociação da SCZ adulta
- Antes do preparo da cultura, coloque a matriz cerebral e a navalha de dois gumes no gelo.
Nota: Não congele a matriz cerebral, pois o cérebro pode se ligar a ela.
- Sacrifique um camundongo (8 semanas de idade) por asfixia por CO2 ou luxação cervical.
- Corte a cabeça com uma tesoura afiada após pulverizar etanol a 70%. Para imobilizar a cabeça, segure os dois lados da cabeça com força. Corte a pele com uma tesoura na linha média no sentido caudal-rostral. Isso promove a remoção completa da pele do crânio.
- Remova a parte caudal do crânio (posterior à lambda) primeiro e, em seguida, insira a pinça entre o crânio e o cérebro na posição da linha média dorsal. Pegue o osso parietal esquerdo (ou direito) e retire-o com cuidado. Repita este procedimento para a remoção do outro osso parietal.
Nota: A desconexão do nervo óptico e a remoção das meninges do cérebro facilitam a separação do cérebro do crânio.
- Transfira o cérebro para o tampão PBS frio (25 ml) e enxágue duas vezes para remover o excesso de sangue.
- Coloque o cérebro na matriz cerebral no gelo e faça cortes coronais para obter fatias de 1 mm de espessura. Transfira as fatias do cérebro (1 mm) contendo as regiões SCZ localizadas na parte posterior do cérebro para um PBS frio em uma placa de Petri de plástico de 35 mm.
cuidado: Para obter um plano paralelo de cortes coronais, certifique-se de que a fissura cerebral seja colocada na linha média da matriz cerebral; É fundamental evitar variações desnecessárias nas seções.
nota: Obtenha fatias de cérebro a 2-3 mm posterior ao bregma; isso permite a separação da ZCC da ZVS (zona subventricular).
- Sob o microscópio de dissecação com baixa ampliação, microdissecar a SCZ da área da substância branca do córtex e hipocampo com uma agulha 30G dobrada6,9. Em seguida, remova as regiões do córtex acima da SCZ. Coloque a região SCZ dissecada das fatias em uma placa de Petri de plástico de 35 mm no gelo sem PBS.
frio
nota: A contaminação de regiões extras contendo neurônios maduros pode afetar a viabilidade de aNSCs e a formação de neuroesferas porque eles sofrem morte celular em condições de cultura de aNSC.
- Usando uma agulha dobrada de 30 G, corte imediatamente os tecidos dissecados em pedaços pequenos.
nota: Se for necessário mais tempo para dissecar o tecido SCZ, mergulhe os tecidos dissecados em PBS frio antes de cortar.
- Ressuspenda o tecido picado com 1 ml de tampão de digestão, transfira o tecido para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de digestão e incube-o por 30 min em banho-maria a 37°C.
nota: Agite o tubo a cada 10 minutos para misturar bem.
3. Cultura de células-tronco neurais adultas derivadas da zona subcalosa
- Bata levemente no tubo para dissociar o tecido digerido e, em seguida, centrifugue o tubo a 145 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o tecido digerido com 1 mL de meio N2 pré-aquecido para lavar o tampão de digestão e pipete suavemente a solução de amostra no máximo 5 vezes usando uma pipeta P1000.
nota: A trituração excessiva com uma ponta de pipeta estreita pode diminuir a viabilidade celular e o crescimento subsequente.
- Centrifugue o tubo a 145 x g por 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 ml de meio N2.
- Preparar 1 ml de meio N2 numa placa de 6 poços não revestida e adicionar 1 ml das células em suspensão para perfazer um volume final de 2 ml.
- Adicione EGF (20 ng/ml) e bFGF (20 ng/ml) em cada poço. Agite suavemente a placa de cultura de 6 poços com a mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Mantenha a placa de 6 poços em uma incubadora de 37 ° C e 5% de CO2.
- Adicione EGF (20 ng/ml) e bFGF (20 ng/ml) a cada poço todos os dias durante 8 dias. De três em três dias, adicionar 200 μl de meio N2 para manter o volume aproximado de 2 ml do meio.
4. Passagem de NSCs como neuroesferas e para culturas de monocamada
- Reúna as neuroesferas e transfira-as para um novo tubo cônico de 15 ml.
Nota: O número de neuroesferas (>50 μm de diâmetro) por poço da SCZ de um único cérebro de camundongo foi de 64,3 ± 7,31, que foi menor que o da SVZ (190,5 ± 6,33).
- Incube as neuroesferas com 0,5 ml de tampão de dissociação por 5 min em banho-maria a 37 ° C para dissociar as neuroesferas em células únicas. As neuroesferas primárias podem ser dissociadas em células únicas e mantidas em várias passagens como neuroesferas ou culturas de monocamada.
nota: A expansão de SCZ-aNSCs como uma monocamada é superior às neuroesferas porque as SCZ-aNSCs podem ser passadas >10 vezes em um formato de cultura de monocamada, mas <5 vezes em um formato de cultura de neuroesfera.
cuidado: SCZ-aNSCs exibem forte agregação e é difícil dissociá-los em células únicas. Assim, o formato de cultura da neuroesfera não é recomendado para expansão celular de rotina.
- Pipetar suavemente a solução da amostra para cima e para baixo com uma pipeta P1000 menos de 5 vezes e centrifugar o tubo a 145 x g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as neuroesferas com 1 ml de meio N2.
nota: A titulação excessiva com uma ponta de pipeta estreita pode diminuir a viabilidade celular e o crescimento subsequente.
- Para contar as células, faça uma mistura 1:1 da suspensão celular (10 μl) e a solução de azul de tripano a 0,4% e, em seguida, conte o número de células vivas em um hematocitômetro. Depois de revestir uma placa de 6 poços com PLO/laminina, coloque as células em placas a 2,5 x 105 células/ml com 2 ml de meio N2 para cada poço.
nota: Mudanças na densidade celular podem afetar sua condição e potencial de diferenciação.
- Mantenha os SCZ-aNSCs com um tratamento diário de fatores de crescimento (2 ml, 20 ng/ml) por 5 dias e depois passe-os.
5. Diferenciação de células-tronco neurais adultas derivadas da zona subcalosa
- Colocar aNSCs em uma lamínula de 18 mm revestida com PLO/Laminina com 1 x 105 células/ml em 1 ml de N2 com fatores de crescimento (20 ng/ml) para diferenciação dos SCZ-aNSCs.
- No dia seguinte, quando as células estiverem firmemente presas à lamínula, troque o meio de crescimento por N2 para remover os fatores de crescimento.
- Após 6 dias, lavar as células diferenciadas com 1 ml de PBS para remover os restos celulares e fixá-las para imunocoloração.
Nota: BrdU pode ser incorporado ao DNA recém-sintetizado de células em proliferação. Portanto, se desejado, BrdU (10 μg / ml) pode ser adicionado às células vivas antes da fixação das células.
