Estabelecendo uma co-cultura de células da polpa dentária e neurônios do trigêmeo para comunicação cruzada

Resumo

Fonte: Barkley, C. et al., Um método de co-cultura para estudar o crescimento de neuritos em resposta a sinais parácrinos da polpa dentária.J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo mostra uma técnica para estabelecer uma co-cultura de neurônios trigêmeos e células primárias da polpa dentária usando um filtro transwell. Nessa condição fisicamente separada, as células mesenquimais obtidas do tecido da polpa dentária secretam moléculas sinalizadoras parácrinas que atravessam os poros, promovendo a diferenciação e migração de neurônios em direção às células mesenquimais, estabelecendo um sistema de co-cultura.

Protocolo

1. Preparação da placa

NOTA: Certifique-se de que a tampa da placa esteja colocada durante todas as etapas de incubação e enxágue fora da capa de cultura de tecidos estéreis para evitar contaminação durante o processamento da amostra.

1. Filtros de revestimento
   1. Diluir a laminina a 10 μg/ml. Filtre a laminina diluída sob o capô.
   2. Pipete 450-500 μL de 10 μg/mL de laminina em cada alvéolo de uma placa de 24 poços.
   3. Colocar um filtro transwell de porosidade de 3 μm num poço de modo a que entre em contacto com a solução de laminina e deixá-lo numa incubadora a 37 °C durante 2 h ou durante a noite. Os poros do filtro devem permitir que parte da solução se difunda e cubra a parte superior e inferior do filtro. Esses filtros devem ser usados dentro de 48 h ou refrigerados a 4 °C por até 1 semana.

2. Revestimento celular

1. Camundongos: A alteração genética das células da polpa dentária (DP) pode ser realizada (mas não é obrigatória) para estudar as interações mesenquimais-neuronais.
2. Dissecção DP, dispersão e plaqueamento (Figura 1)
   NOTA: Para dissecção DP, use pinça ultrafina de borda reta. As bordas ultrafinas permitirão que o usuário encaixe a borda da pinça entre a estrutura mineralizada e o tecido DP.
   1. Colher camundongos P5-P8. Nesta fase, os dentes devem estar mineralizando e a raiz aberta.
   2. Anestesiar os neonatos por meio de hipotermia, colocando-os em um prato na geladeira a 4 °C até que não se movam mais ou respondam ao toque. Eutanasiar neonatos por decapitação e de acordo com os procedimentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na instalação designada.
   3. Prepare uma alíquota de 3-5 mL de ácido tetracético tripsina a 0,25% de tripsina-etilenodiamina (tripsina-EDTA) em um tubo cônico de 50 mL para coletar o DP de cada camundongo. Isso facilitará a digestão da polpa dentária de camundongos pós-natais. Use mais de 3 mL se digerir tecido de mais de 10 camundongos pós-natais.
   4. Coloque a cabeça em uma almofada descartável de modo que a boca fique voltada para o teto e a base do pescoço fique plana na superfície de trabalho. Use uma lâmina de barbear em um movimento de serra para separar a mandíbula da maxila.
   5. Opcionalmente, remova a língua com uma tesoura ou com uma pinça para permitir um acesso mais fácil aos molares.
   6. Coloque a cabeça aberta em um prato sobre uma gaze estéril e coloque a amostra sob um microscópio de dissecação (Figura 1D).
   7. Remova o tecido ósseo alveolar ao redor dos primeiros molares. Os dentes submandibulares não estão totalmente erupcionados neste momento. Insira uma pinça na abertura alveolar e afaste o tecido do dente em direção ao lado bucal (bochecha) ou lingual (língua) da boca. Os dentes maxilares exigirão a remoção completa da fenda ao redor do dente para exposição e remoção.
   8. Transfira suavemente os primeiros molares submandibulares e superiores (M1s) para uma placa de cultura de células separada com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   9. Repetir 2.2.4-2.2.8 até que todos os M1s sejam recolhidos. Mantenha o prato contendo os M1s no gelo durante a colheita.
   10. Remova o órgão externo do esmalte (EOE) ao redor da parte externa de cada M1. Isso pode ser feito alternativamente após a etapa 2.2.11.
   11. Com um conjunto de pinças, gire o M1 para que as cúspides fiquem para baixo e a raiz aberta fique exposta. Haverá uma abertura oval na parte inferior do dente e tecido DP opaco encapsulado por uma fina camada de dentina e esmalte.
   12. Usando a ponta da pinça, afrouxe suavemente o DP passando um braço da pinça ao redor da circunferência interna do tecido mineralizado. Remova o tecido DP da estrutura mineralizada e transfira-o para um terceiro prato contendo 1x PBS. Remova o EOE se ainda não estiver separado (Figura 1E).
   13. Transfira todo o tecido DP para tripsina-EDTA a 0,25% em um tubo cônico de 50 mL. Vortex a mistura e coloque em banho-maria morna a 37 °C por 10 min. Isso pode ser feito com a mesma pinça ou com pinças longas para frascos. O tecido será difícil de dispersar e exigirá vórtice a cada 3-4 minutos. NÃO exceda 10 minutos de tripsinização, pois a tripsina pode danificar as membranas celulares.
   14. Sob uma capa estéril, adicione meios de co-cultura aquecidos (Tabela 1) a uma proporção final de pelo menos 1:1 para tripsina para inativar a enzima. Proporções maiores são aceitáveis se mais dispersão tecidual for desejada.
   15. Pipete o meio para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 10 mL para dispersar ainda mais o DP no meio. Tenha cuidado para evitar bolhas grandes. A dispersão completa é quase impossível devido à natureza pegajosa do tecido. No entanto, também não é necessário, pois as células migrarão para fora do tecido uma vez plaqueadas.
   16. Transfira 1 mL do DP disperso para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (Figura 1F).
   17. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C e deixar as células fixarem-se e migrarem para fora do tecido não disperso durante 48 h antes de mudarem de meio. As células primárias precisam ser plaqueadas em concentrações relativamente altas para atingir 85-90% de confluência em 1 semana. Se isso não for alcançado após 1 semana, descarte o prato.
3. Dissecção, dispersão e plaqueamento do neurônio trigêmeo
   NOTA: Neste protocolo, a imagem do crescimento de neuritos em co-cultura com células DP foi otimizada usando B6 adolescente (6 semanas de idade). Camundongos Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J. Os sistemas nervosos central e periférico de camundongos Thy1-YFP têm uma etiqueta de proteína fluorescente amarela (YFP) cuja expressão começa em torno de P6-P10 nos neurônios e aumenta exponencialmente em todo o sistema nervoso durante a vida pós-natal e adulta. YFP e GFP conservaram sequências que permitem que esses nervos sejam corados com anticorpos anti-GFP, resultando em uma coloração pan-neuronal. Em última análise, esses camundongos permitem uma melhor visualização e quantificação dos neurônios usados e cultivados em cultura de células.       
   1. Eutanásia de camundongos adolescentes com dióxido de carbono seguido de luxação cervical.
   2. Decapite os ratos e remova a pele do crânio. Certifique-se de incluir números equivalentes de homens e mulheres.
   3. Insira a ponta de uma tesoura de microdissecação na base do crânio. Corte ao longo da sutura sagital do crânio (Figura 1A).
   4. Faça quatro pequenos cortes horizontais: dois ao longo das suturas coronais pelas orelhas e dois ao longo das suturas lambdoides na base do crânio. Isso deve criar duas abas de osso.
   5. Use a pinça para retirar as duas abas de osso. Isso deve revelar o cérebro.
   6. Remova o cérebro. Transfira a cabeça para uma placa de cultura de tecidos com 1x PBS e coloque sob o microscópio.
   7. Localize os gânglios do trigêmeo (TG), que são facilmente visíveis em roedores¹³, alojados na dura-máter entre o cérebro e o osso do processo maxilar (Figura 1B).
   8. Corte os três ramos que viajam para os olhos, maxila e mandíbula e transfira os gânglios para 1x PBS frio usando uma pinça fina de ponta reta. Mantenha o prato contendo os gânglios TG no gelo durante a colheita.
   9. Uma vez que todos os feixes de TG são colhidos, transfira os gânglios para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mg / mL de colagenase tipo II filtrada estéril usando uma pinça de frasco.
   10. Vortex a colagenase com o feixe de TG e coloque o tubo em banho-maria a 37 °C por 25-30 min. Durante esse tempo, retire o tubo cônico do banho-maria, vórtice e retorne ao banho a cada 5-10 minutos.
   11. Centrifugue a solução de neurônios de colagenase-TG por 2 min a 643 x g.
   12. Sob uma capa de cultura de tecidos, aspire suavemente a colagenase com uma micropipeta.
   13. Adicione 5 mL de tripsina filtrada estéril a 1% tipo II e vórtice. Colocar o tubo cónico num banho-maria a 37 °C durante 5 min.
   14. Centrifugue a mistura de tripsina-TG por 5 min a 643 x g. Remova a porção superior da tripsina com uma micropipeta, para que os neurônios TG não sejam removidos. Ainda haverá líquido no tubo.
   15. Adicione mídia suficiente para desativar a tripsina restante (a uma proporção de 1:1 ou inferior de tripsina para mídia).
   16. Conte o número de células e dilua a solução para 200.000 células/mL (250 μL de células contendo 50.000 células).
   17. Coloque os filtros transwell revestidos da seção 1.2 em poços com DP.
   18. Dilua a solução contendo células para que haja 200.000 células/mL. Pipetar 250 μL no filtro transwell e cultivar as células a 37 °C durante a noite (Figura 1F).
   19. No dia seguinte, substitua o meio por 1 mL de meio de co-cultura com 1 μM de uridina e 15 μM de 5'-fluoro-2 desoxiuridina para impedir a proliferação excessiva de células mesenquimais que podem impedir o crescimento de neurites. Opcional: Adicione fatores de crescimento ou inibidores neste meio se tentar manipular mais.

Tabela 1: Meios de co-cultura.

componente	volume	concentração
MEM α	440 mL
Soro fetal bovino inativado por calor	50 mL	10% de sucesso
100x L-glutamina	5 ml	1x
Penicilina-estreptomicina 100 x	5 ml	1x
Altere o meio no dia 2 com inibidores mitóticos nessas concentrações finais
Uridina		1 μM
5'-Fluor-2'desoxiuridina		15 μM

Resultados

Figura 1: Um esquema da dissecção do camundongo para obter células para co-cultura.(A) Um diagrama de onde cortar para abrir o crânio do rato e localizar os nervos TG, mostrado em preto na última representação. A tesoura indica onde inserir as pontas da tesoura para cortar ao longo das linhas pontilhadas. (B) Uma imagem combinada de campo escuro e GFP mostrando os ne...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-Fluoro-2'-desoxiuridina	Sigma-Aldrich	F0503	Usado como inibidor mitótico na concentração de 15 μM em meios de co-cultura, Dia 2
Placa de cultura de células de 24 poços	Corning	3524	Placa de co-cultura
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	O Laboratório Jackson	12603	Modelo de camundongo Tgfbr2f/f usado para células da polpa dentária em protocolo otimizado
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	O Laboratório Jackson	3709	Genótipo de modelo de camundongo Thy1-YFP usado para neurônios trigêmeos
Colagenase Tipo II	Millipore	234155-100MG	Usado para dispersar neurônios do trigêmeo
Soro fetal bovino	Gibco	Rolamento 10437	Aditivo para meios de cocultura
Pinça fina	Ferramentas de Belas Ciências	11413-11	Pinça fina para dissecção TG
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Cobre as inserções transwell na concentração final de 10 μg/ml, a solução estoque é assumida em 1,5 mg/ml
L-Glutamina	Gibco	25030081	Aditivo para meios de cocultura
Tesoura de microdissecação	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Tesoura de dissecção para abrir o crânio
Meio essencial mínimo a	Gibco	12571063	Base de mídia de co-cultura
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070063	Aditivo antibiótico para meios de co-cultura
Inibidor de fosfatase	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Aditivo ao tampão RIPA para extração de proteínas de células da polpa dentária pós-co-cultura
Folheto de cultura de células ThinCert	Greiner Bio-One	662631	Insertos Transwell para neurônios do trigêmeo em ensaios de co-cultura
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Usado para dispersar células da polpa dentária
Tripsina Tipo II	Sigma-Aldrich	T-7409	Usado para dispersar neurônios do trigêmeo
Pinça Ultra Fina	Ferramentas de Belas Ciências	11370-40	Pinça ultrafina para dissecção
Uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Usado como inibidor mitótico na concentração de 1 μM em meios de co-cultura, Dia 2
Pinça de frasco	Ferramentas de Belas Ciências	110006-15	Pinça longa para transferência de tecido para cônicos