1. Cultura e Armazenamento de Células Endoteliais Periventriculares Humanas
- Manter as células endoteliais periventriculares humanas em placas de 6 poços revestidas com matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) em meio de células endoteliais periventriculares (meio E6 contendo 50 ng/mL de fator de crescimento endotelial vascular A [VEGF-A], fator de crescimento de fibroblastos 100 ng/mL 2 [FGF2] e 5 μM de ácido gama-aminobutírico [GABA]) a 37 °C e 5% de CO2. Mude de meio a cada dia alternado.
- Descongele a matriz da membrana basal a 4 ° C e faça uma solução 1: 100 diluindo-a no meio Eagle modificado frio de Dulbecco / meio de mistura de nutrientes F-12 (DMEM / F12). Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de matriz. Incubar as placas a 37 °C durante pelo menos 1 h antes da utilização.
- Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam uma confluência de 80% a 90%. Aspirar o meio do poço. Lave os poços uma vez com 1 mL de solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) por poço.
- Separe as células adicionando 1 mL de solução de dissociação celular (consulte a Tabela de Materiais) por poço. Incubar a 37 °C durante 5 min. Após 5 min, adicione 1 mL de meio de células endoteliais periventriculares. Transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mL.
nota: Usamos Accutase para dissociação celular aqui, em oposição a TrypLE nas seções 3 e 4.
- Centrifugue as células a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de células endoteliais periventriculares.
- Conte as células vivas usando o método de exclusão de azul de tripano. Células-semente em placas frescas revestidas com matriz a uma densidade de 1,2 x 105 células/cm2. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
- Armazene as células endoteliais periventriculares humanas por criopreservação em meio de congelamento (90% de meio de células endoteliais periventriculares e 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]).
- Dissocie e colete células seguindo as etapas 1.3 e 1.4 acima. Conte as células na solução pelo método de exclusão do azul de tripano.
- Centrifugue as células a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular a 5 x 106 células/ml de meio de congelação.
- Dispense 1 mL de meio de congelamento mais células por criogenia. Coloque os frascos para injetáveis em uma câmara cheia de isopropanol e deixe esfriar durante a noite a -80 ° C a 1 ° C / min. Transfira os frascos para um tanque de nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.
2. Preparação de Células Endoteliais Periventriculares Humanas para Ensaio
- Permitir que as células endoteliais periventriculares humanas atinjam 70%-80% de confluência.
- Dissocie as células seguindo as etapas 1.3 a 1.5, conforme descrito acima. Conte as células usando o método de exclusão azul de tripano.
3. Preparação de Interneurônios GABAérgicos Humanos para Ensaio
NOTA: Os interneurônios GABAérgicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) e o meio neuronal foram adquiridos comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Os neurônios são gerados pela diferenciação de uma linha de iPSC derivada de fibroblastos humanos seguindo um protocolo desenvolvido pelo fabricante. As células foram descongeladas e cultivadas de acordo com o protocolo do fabricante.
- Descongele os interneurônios GABAérgicos humanos e cultive-os em uma placa de 12 poços por duas semanas até uma confluência de 70% a 80%.
- No dia do ensaio, solução de dissociação celular quente (ver Tabela de Materiais) e uma alíquota de meio neuronal a 37 °C durante 10 minutos antes da utilização.
- Aspirar o meio de cada alvéolo que contém as células. Lave as células com 1 mL de PBS estéril 1x por poço.
- Separe as células adicionando 0,5 mL de solução de dissociação pré-aquecida por poço e incube a 37 ° C por 5 min. Adicione 1 mL de meio neuronal por poço. Transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mL. Triturar suavemente para dissociar aglomerados de células.
- Centrifugue as células a 380 x g por 5 min à temperatura ambiente, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio neuronal. Conte as células vivas usando o método de exclusão de azul de tripano.
4. Preparação de células endoteliais humanas de controle para ensaio
NOTA: As células endoteliais derivadas de iPSC humanas de controle e o meio de células endoteliais foram adquiridos comercialmente (Tabela de Materiais). Essas células endoteliais são geradas pela diferenciação de uma linha iPSC derivada de fibroblastos humanos para o destino endotelial seguindo um protocolo desenvolvido pelo fabricante. As células foram descongeladas e cultivadas em substrato de fibronectina de acordo com o protocolo do fabricante. As placas revestidas com fibronectina foram preparadas seguindo o protocolo do fabricante.
- Descongele as células endoteliais humanas de controle e cultive-as em uma placa de 6 poços até uma confluência de 80% a 90%.
- No dia do ensaio, solução de dissociação celular quente (ver Tabela de Materiais) e uma alíquota de meio endotelial a 37 °C durante 10 min antes da utilização.
- Aspire o meio de cada poço contendo as células. Lave as células com 1 mL de PBS estéril 1x por poço.
- Separe as células adicionando 0,5 mL de solução de dissociação pré-aquecida por poço. Incubar em temperatura ambiente por 5 min. Adicione 1 mL de meio de células endoteliais por poço para neutralizar a solução de dissociação. Transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugue as células a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de células endoteliais. Conte as células vivas usando o método de exclusão de azul de tripano.
5. Preparação de Insertos de Cultura de Um Poço
- Descongelar 1 mg/ml de solução de laminina à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Cubra um número apropriado de placas de 35 mm com solução de poli-L-ornitina a 0,01% (1 mL por placa). Incube os pratos em temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
- Diluir 1 mg/ml de solução de laminina a 1:300 em água estéril até uma concentração final de 3,3 μg/ml imediatamente antes da utilização.
- Aspire completamente a poli-L-ornitina de cada prato. Enxágue bem cada prato 3x com água estéril e aspire completamente para evitar a toxicidade celular induzida por poli-L-ornitina.
- Adicione 1 mL de solução de laminina a 3,3 μg/mL a cada placa e incube a 37 °C durante a noite ou pelo menos 1 h. Remova a solução de laminina da placa imediatamente antes de usar.
nota: Em alternativa, conservar as placas contendo laminina a 4 °C. Equilibrar as placas numa incubadora de cultura de células a 37 °C antes de utilizar.
- Corte três lados de um poço de um inserto de cultura de silicone de dois poços (Figura 1A) usando uma lâmina estéril para gerar um inserto de um poço (Figura 1B).
nota: Mantenha o inserto de dois poços firmemente preso à superfície da embalagem original durante o corte para garantir um corte suave e proteger a aderência do inserto.
- Aspirar solução de laminina da louça.
nota: Não lave a louça com PBS estéril ou água após a incubação da laminina. Superfícies molhadas impedirão a adesão firme do inserto de cultura.
- Remova o inserto de um poço com uma pinça estéril e coloque-o no centro do prato revestido de poli-L-ornitina/laminina. Pressione ao longo das bordas do inserto para fixá-lo na superfície do prato.
- Vire cuidadosamente o prato de cabeça para baixo para verificar se a inserção está firmemente aderida.
- Mantenha o prato de cabeça para baixo e marque o limite do compartimento de inserção usando um marcador preto permanente com uma ponta ultrafina (Figura 1C).
6. Ensaio de Migração de Co-cultura
- Co-suspende 3 x 104 interneurônios GABAérgicos e 3 x 104 células endoteliais periventriculares humanas em 70 μL de meio de cocultura (50% meio de manutenção periventricular sem GABA e 50% meio neuronal). Semeie esta solução de célula dentro do compartimento de inserção de um poço. Prepare um número adequado de placas de ensaio.
nota: O GABA não foi adicionado ao meio de co-cultura para excluir o efeito do GABA exógeno na migração.
- Verifique ao microscópio se as células não estão vazando do compartimento de inserção.
- Adicione lentamente 1 mL de meio de co-cultura ao longo da lateral do prato para evitar que o revestimento seque.
nota: Adicione o meio lentamente ao longo da borda do prato para que a inserção não seja perturbada.
- Como primeiro controle, semeie 3 x 104 interneurônios GABAérgicos humanos apenas em 70 μL de meio de co-cultura por inserção de um poço. Prepare um número adequado desses pratos.
- Como segundo controle, co-semeie 3 x 104 interneurônios humanos GABAérgicos com 3 x 104 células endoteliais humanas de controle em 70 μL de meio de co-cultura por inserção de um poço. Prepare um número adequado de pratos.
- Incubar os pratos durante 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Após 24 horas de incubação, verifique ao microscópio se as células se fixaram corretamente e se não há vazamento.
- Após 48 h de semeadura, remova cuidadosamente o inserto usando uma pinça estéril. Verifique ao microscópio se a camada celular não está perturbada (dia 0).
- Remova o meio e adicione 1 mL de meio de co-cultura fresco.
nota: Reserve um número adequado de pratos para adquirir imagens do dia 0.
- Incubar as células durante 5 dias a 37 °C e 5% de CO2.
