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1. Preparação dos AMA
Nota: Os MEAs são compostos por um substrato de vidro, eletrodos de metal microfabricados e uma camada de isolamento de polímero SU-8. Para o propósito deste estudo, os MEAs disponíveis comercialmente foram solicitados com um layout de feixe de eletrodos personalizado (Figura 1 A & B). Os 68 eletrodos são dispostos em uma grade retangular que é dividida em duas zonas por uma ranhura de 300 μm de largura, livre de eletrodos, cabos elétricos e isolamento. Cada eletrodo tem 40 x 40 μm de tamanho e eles são espaçados por 200 μm de centro a centro. Quatro grandes eletrodos de aterramento são posicionados ao redor do local de gravação. Eles diferem de outros MEAs padrão disponíveis comercialmente em seu tamanho (21 mm x 21 mm) e não possuem câmara de gravação fixa.
- Para desinfecção, enxágue os MEAs em etanol 100% (2x), etanol 70% (1x) e água destilada (2x) por pelo menos 30 segundos cada. Deixe secar. Coloque 10 - 12 MEAs em uma placa de Petri de vidro limpa (150 mm x 25 mm) e feche a tampa.
- Autoclave MEAs por 20 min a 120 °C. Armazene em RT.
- Preparar a solução de revestimento (ver lista de materiais) para os MEAs e armazenar alíquotas a -20 °C.
- Colocar cada MEA numa placa de Petri estéril individual (35 mm x 10 mm).
- Use uma pipeta resfriada para colocar 150 μl de solução de revestimento resfriada em cima dos eletrodos e feche a tampa da placa de Petri. Após cerca de 10 minutos, verifique se há bolhas de ar na parte superior dos eletrodos e remova-as suavemente com uma espátula coberta de borracha, se necessário. Deixe descansar por 1 hora em temperatura ambiente (RT).
- Aspire os resíduos da solução de revestimento, lave 1x com meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários e 2x com água destilada e estéril. Se os MEAs não forem usados até o dia seguinte, mantenha-os em água destilada e estéril a 37 °C na incubadora durante a noite (O/N). Caso contrário, deixe secar diretamente em RT.
2. Ingredientes necessários para a preparação e crescimento de culturas organotípicas
- Prepare uma solução de lavagem sem cálcio (consulte a lista de materiais).
- Reconstituir o plasma de frango em solução de lavagem (1:1, agitar suavemente, evitar a formação de bolhas), centrifugar a 3.000 x g durante cerca de 20 min e transcantar o conteúdo límpido para um tubo estéril. Alíquota de 200 μl em criotubos e armazenar a -20 °C.
- Reconstitua a trombina do plasma bovino de acordo (200 U / ml) e filtro estéril (filtro de poros de 0,2 μm). Alíquota de 200 μl em critotubos e armazenar a -20 °C.
- Para 30 culturas, prepare 100 ml de meio nutriente (consulte a lista de materiais).
3. Dissecção do tecido da medula espinhal
Nota: O procedimento produz, dependendo do número de embriões, fatias da medula espinhal para cerca de 25 a 35 coculturas e é preparado dentro de uma capela de fluxo laminar em condições estéreis.
- Aplicar uma dose letal de pentobarbital (0,4 ml) na mãe animal por injeção intramuscular. Confirme a anestesia profunda verificando o reflexo de retirada do pedal. Entregar embriões embrionários de rato dia 14 (E14) por cesariana e sacrifício por decapitação.
- Transfira os corpos dos embriões para uma placa de Petri cheia de solução estéril e gelada.
- Realizar um corte transversal completo com bisturi acima dos membros posteriores e outro acima dos membros anteriores e retirar os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da peça posterior que contém a medula espinhal.
- Para fatiar, transfira as peças traseiras contendo a medula espinhal, uma de cada vez, em um disco de montagem e corte a uma espessura de 225 - 250 μm com um picador de tecido. Coloque uma gota de solução de lavagem sobre o tecido picado e transfira as fatias com uma espátula em placas de Petri de 35 mm x 10 mm cheias de solução de lavagem estéril e gelada.
- Para cada fatia separadamente, disseque a medula espinhal longe do tecido restante. Deixe os gânglios da raiz dorsal presos.
- Deixe as fatias descansarem por 1 hora a 4 °C.
4. Montagem de fatias de tecido da medula espinhal em MEAs
- Aqueça o meio nutriente estéril na incubadora (37 °C, tampa levemente desenroscada para oxigenação).
- Posicione o MEA com uma pinça estéril com pontas revestidas de borracha em RT na placa de Petri sob um microscópio estéreo com o conjunto de eletrodos em foco. Centralize uma gota de 6 μl de plasma de galinha no conjunto de eletrodos limpo, livre de poeira e estéril. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente duas seções da medula espinhal com os lados ventrais voltados um para o outro na gotícula de plasma. Não toque nos eletrodos com a espátula.
- Adicione 8 μl de trombina ao redor da gota de plasma de galinha. Usando a ponta da pipeta de trombina, misture cuidadosamente e espalhe a mistura de plasma de frango/trombina ao redor das duas fatias. Novamente, não toque diretamente no conjunto de eletrodos quebradiços. Imediatamente antes da coagulação, aspire o excesso de plasma/trombina de galinha.
- Tampe a placa de Petri para reter alta umidade enquanto o conjunto MEA/cultura permanece por cerca de 1 hora em uma câmara umidificada dentro da incubadora a 37 °C.
- Adicione cuidadosamente 10 μl de meio nutriente à câmara de cultura, tampe a placa de Petri e coloque de volta na incubadora por cerca de 30 min.
- Coloque cada conjunto MEA/cultura com pontas estéreis cobertas de borracha em um tubo de rolo, adicione 3 ml de meio nutriente e feche bem a tampa. Coloque o tubo do rolo no tambor de rolos girando a 1 - 2 rpm na incubadora em uma atmosfera contendo 5% de CO2 a 37 °C.
- Troque metade do meio nutriente após 7 dias in vitro (DIV) e depois 1 - 2 vezes por semana.
5. Lesões Mecânicas
- Retire o conjunto MEA/cultura com pontas estéreis cobertas de borracha do tubo do rolo e coloque em uma placa de Petri sem meio nutriente sob um microscópio estéreo com o tecido em foco. Verifique visualmente se as duas fatias estão fundidas.
- Segure o conjunto MEA/cultura com firmeza colocando pinças com pontas cobertas de borracha no MEA.
- Coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do MEA perto das fatias de tecido. Segure o bisturi na horizontal.
- Levante o cabo do bisturi, mas deixe a lâmina do bisturi ficar na ranhura do MEA de forma que a lâmina "role" da base às pontas e, assim, corte o tecido que cobre a ranhura.
- Grave quaisquer conexões de tecido residual com uma ponta de agulha de 25 G, se necessário. Trabalhe apenas na área dentro da ranhura e não toque nas bordas macias.
- Coloque o conjunto MEA/cultura de volta no tubo do rolo. Forneça 3 ml de meio nutriente fresco às culturas e coloque-as de volta no tambor de rolos na incubadora.
6. Registros eletrofisiológicos da atividade espontânea
- Para investigar a regeneração funcional entre as duas fatias da medula espinhal após o número escolhido de DIV, monte o conjunto MEA/cultura em uma câmara de registro em um microscópio e aplique cerca de 500 μl de solução extracelular (ver lista de materiais).
- Aguarde 10 minutos antes da primeira gravação para permitir que o sistema se estabilize.
- Registre a atividade espontânea básica 2x por cerca de 10 min de cada eletrodo de detecção de atividade do MEA em RT.
- Para garantir condições extracelulares estáveis, troque a solução extracelular após cada sessão de gravação.
