Estudando a regeneração de conexões funcionais entre fatias da medula espinhal usando um arranjo de múltiplos eletrodos

Resumo

Fonte: Heidemann, M., et al. Investigando a regeneração funcional em coculturas organotípicas da medula espinhal cultivadas em matrizes de vários eletrodos. J. Vis. Exp. (2015).

O vídeo demonstra a regeneração funcional das conexões proprioespinhais usando um ensaio baseado em matriz de múltiplos eletrodos (MEA). As fatias da medula espinhal são colocadas no MEA e podem se fundir. As fatias fundidas são separadas mecanicamente criando uma lesão, induzindo os neurônios proprioespinhais a crescer sobre a lesão e conectar as fatias. A atividade elétrica das fatias é avaliada para identificar a regeneração das conexões funcionais.

Protocolo

1. Preparação dos AMA

Nota: Os MEAs são compostos por um substrato de vidro, eletrodos de metal microfabricados e uma camada de isolamento de polímero SU-8. Para o propósito deste estudo, os MEAs disponíveis comercialmente foram solicitados com um layout de feixe de eletrodos personalizado (Figura 1 A & B). Os 68 eletrodos são dispostos em uma grade retangular que é dividida em duas zonas por uma ranhura de 300 μm de largura, livre de eletrodos, cabos elétricos e isolamento. Cada eletrodo tem 40 x 40 μm de tamanho e eles são espaçados por 200 μm de centro a centro. Quatro grandes eletrodos de....

Resultados

Figura 1. Exibição e análise da atividade espontânea.(A) Diagrama de um MEA. Os eletrodos revestidos de platina são representados em preto, os fios transparentes em vermelho e a ranhura no meio do MEA em amarelo. (B) Close-up do feixe de eletrodos localizado no centro do MEA. Os diagramas são gentilmente fornecidos pelo Dr. M. Heuschkel. (C) Imagem d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz plana de multieletrodos	Qwane Biociências		feito sob medida de acordo com o projeto do nosso laboratório
Meio nutriente			Para 100 ml
Dulbeccos modificou o meio de Eagle	Gibco	Rolamento 31966-021	80 ml
Soro de cavalo	Gibco	Rolamento 26050-070	10 ml
água destilada e estéril			10 ml
Fator de crescimento nervoso-7S [5ng/mL]	Sigma-Aldrich	N0513	200 μl
			reconstituído em solução de lavagem com 1% BSA
Solução de revestimento
Gel de matriz extracelular	BD Biociências	Rolamento 356230	Deve ficar frio o tempo todo; diluir 1:50 com meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários
Meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários	Gibco	Rolamento 21103-049
Solução de lavagem			[mg/L]
MgCl2-6H 2O			100
MgSO4-7H 2O			100
Kcl			400
KH2PO4			60
NaCl			8000
Na2HPO4 anidro			48
D-glicose (dextrose)			1000
			De acordo com o protocolo sobre http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html
Solução extracelular (pH 7,4)			[mM]
NaCl			145
Kcl			4
MgCl2			1
CaCl2			algarismo
HEPES			5
Na-piruvato			algarismo
glicose			5
Plasma de frango	Sigma-Aldrich	Pág. 2366	Liofilizado, reconstituir com solução de lavagem
Micropipeta	Instrumentos de precisão mundiais, Inc.	MF28G-5
Trombina	Merck Millipore	1123740001	irritante, sensibilizante, reconstituir com solução de lavagem
Tubo plano de cultura de tecidos 10 (= tubo de rolo)	Techno Plastic Products AG	Rolamento 91243