1. Semeadura de iPSCs humanas no biorreator
- Incubar iPSCs cultivadas como monocamadas em mTeSR1 suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi). Adicione 1 mL de meio suplementado a cada poço a partir de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços e incube por 1 h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2,
nota: O ROCKi é usado para proteger iPSCs dissociadas da apoptose.
- Após 1 h de incubação, aspirar o meio gasto de cada poço e lavar 1x com 1 mL de 1× PBS por alvéolo.
- Adicione 1 mL do meio de desprendimento de células (consulte a Tabela de Materiais) a cada alvéolo de uma placa de 6 poços e incube a 37 ° C por 7 min até que as células se desprendam facilmente dos poços com uma agitação suave.
- Pipete o meio de descolamento celular para cima e para baixo com uma micropipeta P1000 até que as células se desprendam e se dissociem em células únicas. Adicione 2 mL de meio de cultura celular completo a cada poço para inativar a digestão enzimática e pipetar as células suavemente em um tubo cônico estéril.
- Centrifugar a 210 × g durante 3 min e retirar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em meio de cultura (ou seja, mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi) e conte as iPSCs com um hemocitômetro usando corante azul de tripano.
- Semear 15 × 106 células individuais no biorreator (volume máximo de 100 mL) com 60 mL de mTeSR1 suplementado com 10 μM de ROCKi a uma densidade celular final de 250.000 células/mL.
- Insira o recipiente contendo as iPSCs na unidade de base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
nota: A agitação do biorreator é mantida por 24 h, ajustando o controle da unidade de base universal para 27 rpm para promover a agregação de iPSC.
2. Diferenciação e maturação de agregados derivados de iPSC humanos em organoides cerebelares
- Defina o dia da propagação de célula única como dia 0.
- No dia 1, colete 1 mL da amostra de agregados iPSC usando uma pipeta sorológica. Manter o biorreator sob agitação como antes, colocando a unidade de base universal com o biorreator contendo os agregados em um fluxo estéril antes da coleta da amostra. Coloque a suspensão da célula em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Verifique se os agregados derivados de iPSC são formados.
- Adquira imagens com um microscópio óptico usando uma ampliação total de 40x ou 100x para medir o diâmetro agregado.
- Meça a área dos agregados em cada imagem usando o software FIJI.
- Selecione "Analisar | Definir medidas" na barra de menu e clique em "Área" e "OK".
- Selecione "Arquivo | Abrir" na barra de menus para abrir um arquivo de imagem armazenado. Selecione a ferramenta de seleção de linha apresentada na barra de ferramentas e crie uma linha reta sobre a barra de escala apresentada na imagem. Selecione "Analisar | Definir escala" na barra de menus.
- Em "Distância conhecida", adicione a extensão da barra de escala da imagem em μm. Defina a "Unidade de comprimento" como μm. Clique em "Global" para manter as configurações e "OK". Selecione Seleção oval na barra de ferramentas.
- Para cada agregado, delineie a área com a ferramenta oval. Selecione "Analisar | Meça". Calcule seu diâmetro com base na área medida, considerando que os agregados são aproximadamente esféricos usando
com A como a área do agregado.
- Quando o diâmetro médio dos agregados for de 100 μm, substituir 80% do meio gasto por mTeSR1 fresco sem ROCKi. Quando os agregados atingirem 200–250 μm de diâmetro, substitua todo o meio gasto por gfCDM (Tabela 1), deixando os organoides assentarem na parte inferior do biorreator.
nota: Se o diâmetro médio do agregado exceder 350 μm, não iniciar o protocolo de diferenciação. Repita a semeadura de células individuais. Geralmente, leva cerca de 1 dia para o agregado atingir um diâmetro médio de 100 μm.
- Inserir o biorreator contendo os agregados na unidade de base universal colocada na incubadora a 37 °C, 95% de humidade e 5% de CO2.
- Diminuir a agitação do biorreator para 25 rpm.
- No dia 2, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4 para avaliar o diâmetro do agregado. Adicione 30 μL de FGF2 (concentração final, 50 ng/mL) e 60 μL de SB431542 (concentração final, 10 μM) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM (Tabela 1). Substitua todo o meio gasto do biorreator pelo gfCDM suplementado. Repita a etapa 2.6.
NOTA: SB431542 é crucial para inibir a diferenciação mesendodérmica, induzindo a diferenciação neural. O FGF2 é usado para promover a caudalização do tecido neuroepitelial.
- No dia 5, repita as etapas 2.2, 2.3, 2.4 e 2.8.
nota: O tamanho agregado deve aumentar durante o protocolo de diferenciação. No entanto, o diâmetro só é crítico quando a diferenciação começa, pois esse parâmetro pode influenciar a eficácia da diferenciação.
- No dia 7, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4. Dilua FGF2 e SB431542 a 2/3: Adicione 20 μL de FGF2 e 40 μL de SB431542 a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do biorreator por gfCDM suplementado. Repita a etapa 2.6 e aumente a agitação do biorreator para 30 rpm.
- No dia 14, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4. Adicione 60 μL de FGF19 (concentração final, 100 ng/mL) a 60 mL de meio de diferenciação gfCDM. Substitua todo o meio gasto do biorreator por gfCDM suplementado com FGF19. Repita a etapa 2.6.
nota: O FGF19 é usado para promover a polarização das estruturas do mesencéfalo posterior.
- No dia 18, repita as etapas 2.2, 2.3, 2.4 e 2.11.
- No dia 21, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4. Substitua todo o meio gasto do biorreator por meio neurobasal completo (Tabela 1). Repita a etapa 2.6.
nota: O meio neurobasal é um meio basal usado para manter a população de células neuronais dentro do organoide.
- No dia 28, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4. Adicione 180 μL de SDF1 (concentração final, 300 ng/mL) a 60 mL de meio neurobasal completo. Substitua todo o meio gasto do biorreator por meio neurobasal completo suplementado com SDF1. Repita a etapa 2.6.
nota: O SDF1 é usado para facilitar a organização de camadas celulares distintas.
- No dia 35, repita as etapas 2.2, 2.3 e 2.4. Substitua todo o meio gasto do biorreator por meio BrainPhys completo (Tabela 1). Repita a etapa 2.6.
nota: BrainPhys é um meio neuronal que suporta neurônios sinapticamente ativos.
- Substitua 1/3 do volume total a cada 3 dias por meio BrainPhys completo até o dia 90 de diferenciação.
Tabela 1: Soluções de estoque e preparação de meios. Estão listados todos os componentes e volumes usados para preparar meios para o protocolo de manutenção e diferenciação de iPSCs, bem como soluções de estoque de fatores de crescimento e pequenas moléculas. Para soluções de estoque, todas as concentrações de estoque e protocolos para reconstituição são listados.
| Preparação de mídia | mTeSR1
Volume final: 500 mL | 1. Descongele o suplemento mTeSR1 5× à temperatura ambiente (RT) ou a 4 °C durante a noite e misture com meio basal
2. Armazene o meio mTeSR1 completo a 4 °C por até 2 semanas ou prepare alíquotas de 40 mL e armazene a -20 °C
3. Pré-aqueça o mTeSR1 completo em RT antes de usar |
gfCDM (meio quimicamente definido livre de fator de crescimento)
Volume final: 60 mL | 30 mL de Ham's F12 30 mL IMDM 600 μL concentrado lipídico quimicamente definido (1 % v/v) 2,4 μL de monotioglicerol (450 μM) 30 μL de apo-transferrina (solução-mãe a 30 mg/ml em água, concentração final: 15 μg/ml) 300 mg de BSA purificado por cristalização (5 mg/ml) 42 μL de insulina (concentração reserva a 10 mg/ml, concentração final: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5% v/v, 50 U/ml de penicilina/50 μg/ml de estreptomicina) |
Neurobasal
Volume final: 60 mL | 60 mL de meio neurobasal 600 μL N2 suplemento 600 μL Glutamax I 300 μL P / S (0,5% v / v). |
BrainPhys
completo
Volume final: 60 mL | 60mL de BrainPhys 1,2 mL de Suplemento Neuronal Neurocult SM1 600 μL de Suplemento N2 12 μL de BDNF (concentração final: 20 ng/mL) 12 μL de GDNF (concentração final: 20 ng/mL) 300 μL de Dibutiril-cAMP (concentração estoque: 100 mg/mL em água, concentração final: 1 mM) 42 μL de ácido ascórbico (concentração estoque: 50 μg/mL em água, concentração final: 200 nM) |
| Soluções estoque de fatores de crescimento e pequenas moléculas | Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF/FGF2)
Concentração de estoque: 100 μg/mL | 1. Reconstitua em Tris 5 mM, pH 7,6, na concentração de 10 mg/mL
2. Diluir com 0,1% de BSA em PBS (v/v) até uma concentração final de estoque de 100 μg/mL |
Fator 1 derivado de células estromais (SDF1)
Concentração de estoque: 100 μg/mL | 1. Reconstituir em água na concentração de 10 mg/mL
2. Diluir com 0,1% de BSA (v/v) em PBS até uma concentração final de 100 μg/ml. |
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
Concentração de estoque: 100 μg/mL< |
Fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)
Concentração de estoque: 100 μg/mL |
Fator de crescimento de fibroblastos 19 (FGF19)
Concentração de estoque: 100 μg/mL | 1. Reconstituir em fosfato de sódio 5 mM, pH 7,4, na concentração de 10 mg/mL
2. Diluir com 0,1% de BSA em PBS (v/v) até uma concentração final de estoque de 100 μg/mL |
Inibidor de ROCK Y-27632
Concentração de estoque: 10mM | Reconstituir em DMSO a uma concentração de 10 mM. |
SB431542
Concentração de estoque: 10mM |
Insulina
Concentração de estoque: 10 mg/mL | 1. Reconstituir 10 mg de insulina em 300 μL de NaOH
10 mM
2. Adicione cuidadosamente 1 M NaOH até que a solução se torne transparente
3.Encha até 1 ml com água estéril |
Tabela 2: Soluções para preparação de organoides para criossecção e imunocoloração. Estão listados todos os componentes e volumes utilizados para preparar as soluções utilizadas na preparação de organoides para criossecção e imunocoloração.
Gelatina/Sacarose
Concentração final: 7,5%/15% p/p | 1. Pese 15 g de sacarose e 7,5 g de gelatina em um frasco de vidro Schott estéril e misture bem
2. Pré-aqueça o PBS 1× a 65 °C
3. Adicione PBS 1× pré-aquecido a um peso final de 100 g e misture bem
4. Coloque a garrafa de vidro Schott em uma placa de aquecimento a 65 °C e agite até a gelatina derreter
5. Incubar a 37 °C até que a solução estabilize |
