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Artigo de método

Geração de organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando biorreatores de uso único

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8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

Fonte: Silva, T.P., et al. Geração escalável de organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunocoloração. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um biorreator 3D de uso único. O biorreator facilita a formação de agregados iPSC, que então passam por tratamento com uma série de meios de cultura enriquecidos em fatores de crescimento e quimiocinas que induzem a diferenciação dos agregados iPSC em organoides cerebelares maduros. Posteriormente, os organoides são colhidos e criopreservados para análise posterior.

Protocolo

1. Semeadura de iPSCs humanas no biorreator

  1. Incubar iPSCs cultivadas como monocamadas em mTeSR1 suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi). Adicione 1 mL de meio suplementado a cada poço a partir de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços e incube por 1 h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2,
    nota: O ROCKi é usado para proteger iPSCs dissociadas da apoptose.
  2. Após 1 h de incubação, aspirar o meio gasto de cada poço e lavar 1x com 1 mL de 1× PBS por alvéolo.
  3. Adicione 1 mL do meio de desprendimento de células (consulte a Tabela de Materiais) a cada alvéolo....

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM15793 - 500mLTecnologias de células-tronco
Concentrado lipídico quimicamente definido11905031ThermoFisher
BSA purificado por cristalização Rolamento 5470sigma
DMEM-F12Rolamento 32500-035ThermoFisher
Soro fetal bovinoA3840001ThermoFisher
Gelatina de pele bovinaG9391sigma
Glutamamax I10566-016ThermoFisher
Dibutiril cAMP SC- 201567B -500mg Frilabo
F12 do presunto21765029ThermoFisher
Linha iPSC Episomal HumanaA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
insulina91077Csigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanoPHR1661-2MLsigma
Ácido L-ascórbicoA-92902sigma
MatrigelRolamento 354230Corningmatriz de membrana basal
MonotioglicerolM6154sigma
mTeSR185850 -500mlTecnologias de células-tronco
Suplemento N217502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldeído158127sigma
PBS-0.1 Vaso de uso únicoReferência: IA-0.1-D-001PBS Biotecnologia
PBS-MINI MagDrive Unidade BaseREFERÊNCIA: IA-UNI-B-501PBS Biotecnologia
BDNF humano recombinante450-02Peprotech
bFGF/FGF2 humano recombinante100-18BPeprotech
FGF19 humano recombinante100-32Peprotech
GDNF humano recombinante450-10Peprotech
SDF1 humano recombinante300-28APeprotech
Inibidor de ROCKY-27632 72302Tecnologias de células-tronco
SB431542S4317sigma
sacaroseS7903sigma
Composto Tissue-Tek OCTRolamento 25608-930VWR

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