Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Resumo

Fonte: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolamento e Análise Citométrica de Fluxo de Células Mononucleares do Sangue Periférico Infiltrantes de Glioma. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

Prepare a solução de mistura de meios de centrifugação de densidade colocando 90 ml de PBS 10x em 264 ml de água deionizada ultrapura (3,93x) em um recipiente de plástico estéril. Titular para pH 7,0-7,2 com HCl e esterilizar por filtro através de um filtro de 0,22 μm. Conservar a 4 °C.

Prepare o meio de centrifugação de densidade de 70% combinando 18 ml de solução de mistura de meios de centrifugação de densidade com 30 ml de meio de centrifugação de densidade (consulte a lista de materiais para obter detalhes) em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Conservar a 4 °C, mas levar ao RT antes de utilizar.

Prepare meios de centrifugação com 37% de densidade combinando 9,6 ml de DPBS com 10,4 ml de meios de centrifugação com 70% de densidade em um tubo de centrifugação de 50 ml. Conservar a 4 °C, mas levar ao RT antes de utilizar.

1. Isolamento de PBMCs infiltrantes de glioma

1. Usando uma lâmina de barbear limpa e de um gume, isole a área do cérebro que contém o tumor, fazendo um corte sagital no centro do cérebro para dividir os dois hemisférios. Vire o hemisfério ipsilateral medial para baixo e faça dois cortes coronais nos níveis do cerebelo e do bulbo olfatório para isolar o tecido alvo contendo o implante tumoral (Figura 1A). Uma porção equivalente do hemisfério contralateral também pode ser isolada e usada como controle negativo.
2. Coloque o tecido alvo no moedor de tecido Dounce de vidro rotulado com 1 ml de DPBS, empurre o êmbolo totalmente para baixo e gire 7 vezes para romper inicialmente o tecido. Levante o êmbolo para permitir que o líquido volte para o fundo do moedor de tecidos. Repita esta etapa três vezes; no entanto, gire o êmbolo apenas 4 vezes durante as próximas duas repetições e 3 vezes durante a última repetição para evitar a trituração excessiva do tecido.
3. Usando uma micropipeta P-1000, aplique sequencialmente três volumes de 1 ml de DPBS gelado ao longo das laterais do êmbolo para enxaguar no moedor de tecidos.
4. Ressuspenda a matéria cerebral triturada pipetando para cima e para baixo e colocando-a em um tubo de centrífuga de 15 ml rotulado no gelo. Enxágue as laterais do moedor de lenços Dounce com 1 ml adicional de DPBS gelado e adicione ao mesmo tubo de centrífuga de 15 ml. Mantenha todos os tubos contendo matéria cerebral triturada no gelo até que todas as amostras tenham sido processadas.
5. Uma vez que todas as amostras tenham sido processadas, gire a matéria cerebral triturada nos tubos de centrífuga de 15 ml a 740 x g (RCF máx.) por 20 min a 4 °C.
6. Remover o sobrenadante com uma pipeta serológica de 10 ml e uma pistola de pipetas e ressuspender a massa cerebral peletizada em 1 ml das enzimas digestivas colagenase/DNase-I previamente preparadas utilizando um P-1000. Coloque os tubos de centrífuga de 15 ml em um suporte para tubos de ensaio e coloque em banho-maria a 37 °C por 15 min.
7. Agite suavemente as amostras duas vezes durante o período de incubação, sacudindo os tubos para facilitar a desagregação do tecido.
8. Adicione 6 ml de DPBS gelada usando uma pipeta sorológica de 10 ml a cada tubo para diluir as enzimas digestivas. Pipete para cima e para baixo para ressuspender e filtre os volumes totais através de filtros de malha de nylon estéreis de 70 μm em novos tubos de centrífuga de 15 ml rotulados no gelo.
9. Gire a suspensão de células cerebrais para baixo a 740 x g (RCF máx.) por 20 min a 4 ° C para obter um pellet de célula única ( Figura 1B ). Depois de retirar os tubos de 15 ml da centrífuga, coloque-os sobre gelo e aumente a temperatura da centrífuga para cerca de 21 °C em preparação para a próxima etapa.
10. Remova totalmente o sobrenadante de cada tubo contendo células cerebrais e ressuspenda inicialmente os pellets em 1 ml de meio de centrifugação de densidade de 70% usando uma micropipeta P-1000. Em seguida, adicione 4 mililitros adicionais de meio de centrifugação de densidade de 70% a cada tubo usando uma pipeta sorológica de 10 ml. Aparafuse as tampas com segurança e homogeneize a suspensão da célula invertendo suavemente para os tubos várias vezes.
11. Remova os tubos de centrífuga de 15 ml contendo células cerebrais ressuspensas em meios de centrifugação de densidade de 70% do gelo e coloque em um suporte de tubo de ensaio em RT. Um de cada vez, sobreponha cuidadosamente 2 ml de solução de meio de centrifugação de densidade de 37% nos 5 ml de meio de centrifugação de densidade de 70% com uma micropipeta P-1000 para formar uma interface limpa entre as duas camadas de meio de centrifugação de densidade (Figura 1C).
    1. Use um marcador de ponta fina para indicar a posição da interface para que ela possa ser facilmente identificada após a centrifugação, quando a distinção se tornar menos aparente.
12. Gire os tubos de centrífuga de 15 ml a 740 x g (RCF máx.) por 20 min em RT sem interrupção para evitar interromper a interface.
13. Após a centrifugação, colete os PBMCs que se acumularam na interface entre as duas camadas de meios de centrifugação de densidade (Figura 1D) introduzindo uma micropipeta P-200 no tubo ao longo de seu lado, contornando cuidadosamente a camada lipídica.
    1. Uma vez no nível da banda PBMC, extraia lentamente 200 μl da superfície da camada de meio de centrifugação de densidade de 70% e coloque-a em um tubo FACS de polipropileno rotulado respectivamente no gelo. Repita uma vez para um volume total de 400 μl por amostra.
14. Adicionar 3 ml de tampão de fluxo a cada tubo FACS contendo 400 μl de PBMCs para diluir suficientemente o meio de centrifugação de densidade e, em seguida, centrifugar as células a 660 x g (RCF máx.) durante 20 min a 4 °C.

Resultados

Figura 1: Isolamento de PBMCs infiltrantes de glioma. (A) Estratégia para a dissecção de tecido cerebral de camundongo contendo implantes de glioma ortotópico em estágio inicial. O painel superior demonstra a bissecção sagital do hemisfério ipsilateral longe do hemisfério contralateral. O painel inferior demonstra os dois cortes coronais adicionais necessários para isolar o tecido al...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Modificação de Dulbecco do Eagles Medium	Gibco	Rolamento 12430-054	Com 4,5g/L de D-glicose, L-glutamina, HEPES 25mM e vermelho de fenol
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Gibco	14190-144	Sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio
Soro fetal bovino	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicilina estreptomicina	Gibco	15140-122	10.000U / ml de penicilina; 10.000μg / ml de estreptomicina
0,6 ml de polipropileno cônico microtubos	Genesee Científico	22-272
Balde de gelo em poliuretano	Marca de pescador	02-591-45	Capacidade: 0,152 onças (4,5L)
Colagenase (Tipo I-S)	Sigma Aldrich	C1639	De Clostridium histolyticum
Desoxirribonuclease I	Worthington Bioquímica Corp.	LS002007	> 2.000 unidades Kunitz por mg de peso seco
Tesoura de dissecção grande	Ted Pella Inc.	1316
Tesoura de dissecção pequena	Festa	14094-11
Pinça de extremidade romba	Ted Pella Inc.	13250
Moedor de tecido Dounce de vidro de 7ml	Kontes	KT885300-0007
Meios de centrifugação de densidade Percoll	GE Saúde	GE17-0891-01
Pipetas sorológicas de 10 mL	Genesee Científico	12-104	Uso único; estéril
Filtros de células de malha de nylon estéril de 70μm	Marca de pescador	22363548
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml	Genesee Científico	Artigos 21-103	Fundo cônico
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml	Genesee Científico	21-108	Fundo cônico
Tubos FACS de polipropileno de fundo redondo de 12x75mm	Marca de pescador	14-956-1B