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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de instrumentos, meios de cultura e pratos
- Prepare duas tesouras de dissecação de laboratório de aço inoxidável e duas pinças de laboratório de aço inoxidável. Autoclave todos os instrumentos e coloque em uma capa de cultura O/N sob luz ultravioleta (UV) para esterilização.
- Faça 500 ml de meio de cultura mínimo essencial (MEM) (10% de soro fetal bovino [FBS], 20 mM KCl, 25 mM de NaHCO3, 30 mM de D-glicose, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina e 6 μg / ml de ampicilina) e filtre esterilize. Conservar a 4 °C durante meses.
- Preparar 24 placas de cultura de poços contendo lamínulas de 14 mm de espessura número 1. Autoclave as lamínulas e cubra com poli-d-lisina (PDL) 100 mg/L. A luz UV esteriliza O/N.
2. Preparação de soluções de cultura de células granulares cerebelares (CGC)
- Preparar a «solução A» (100 ml) em dH2O esterilizado, tratado com luz UV, contendo 250 mg de glucose, 300 mg de albumina de soro bovino [BSA], 955 mg de solução salina tamponada com fosfato [PBS] (isenta de Ca2+ e Mg+) e 1 ml de MgSO4,7H 2O a 3,8%.
- Preparar a «solução B» (10 ml) contendo 1 ml de tripsina a 5 mg/ml diluída em 9 ml da solução A.
- Preparar a «solução C» (10 ml) contendo 1.000 unidades de DNase, 0,5 mg de inibidor de tripsina de soja, 100 μl de MgSO4,7H 2O a 3,8%, diluído a 10 ml com a solução A.
- Preparar a «solução D» (20 ml) contendo 3,2 ml da solução C, diluída a 20 ml com a solução A.
- Prepare a solução BSA/Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) contendo EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4·7H2O e 4% BSA, pH 7.4.
- Preparar o éster metílico de L-leucina (LME) adicionando LME puro a 5 ml de meio de cultura MEM para obter uma concentração final de 150 mM LME, retornar a solução a pH 7,4 usando um medidor de pH de bancada e esterilizar por filtro usando um filtro de seringa de poliéter sulfona (PES) de 28 mm 0,2 μm.
3. Cultura dos CGCs
- Colete cerebella de filhotes de rato de 4 a 7 dias. Colocar imediatamente em placa de Petri contendo 5 ml de solução A sobre gelo.
- Despeje o excesso de solução do cerebelo e coloque o tecido na tampa da placa de Petri.
- Pique o tecido finamente com uma lâmina de barbear bem inflamada em pelo menos três direções diferentes.
- Adicione o tecido picado à solução B (lave a placa de Petri com uma solução para garantir que o tecido limitado seja perdido) e coloque no banho-maria a 37 ° C por 5 min. Agite suavemente a cada dois minutos.
- Adicionar a solução D (20 ml) ao tubo para neutralizar a tripsina, agitar e centrifugar a 65 x g durante 5 min.
- Despeje o sobrenadante.
- Ressuspender em 4 ml de solução C. Triturar bem (cerca de 10 vezes cada) com três pipetas de vidro inflamado de diâmetro decrescente, até que a suspensão fique o mais homogénea possível.
- Adicione lenta e suavemente algumas gotas deste homogeneizado em cima do BSA/EBSS. Se começar a afundar através do BSA / EBSS, triture mais e / ou adicione um pouco mais de solução C. O homogenato deve ficar em uma camada sobre o BSA/EBSS. Não agite. Gire a 100 x g por 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento (macio) em 1 ml de meio MEM.
- Conte as células usando um hemocitômetro e placa a 800.000 células/lamínula em 500 μl de meio MEM. Colocar numa incubadora a 37 °C com 6% de CO2.
- Mude o meio no dia seguinte (24-36 horas após a preparação). Fazer uma solução de meio MEM contendo 10 μM do inibidor do ciclo celular arabinofuranosil citidina (AraC).
- Para cada lamínula, reter 250 μl do meio antigo numa nova placa de 24 poços, aspirar o restante, adicionar 250 μl de meio MEM normal e aspirar para lavar as células. Em seguida, adicione os 250 μl de meio antigo de volta às células e complete com 250 μl de meio contendo AraC.
nota: As células podem ser usadas a partir de 6 dias in vitro (DIV).
4. Depleção seletiva da micróglia (realizado a 6 DIV)
- Adicionar LME puro a 5 ml de uma alíquota separada de meio MEM para obter uma concentração final de 150 mM LME.
- Retorne a solução a pH 7,4 e esterilize por filtro usando um filtro de seringa de poliéter sulfona (PES) de 28 mm de 0,2 μm.
- Diluir a solução até uma concentração de 50 mM (2 x LME) em meio MEM e colocar em banho-maria a 37 oC durante 10 minutos, juntamente com o meio MEM normal para as culturas de controlo.
- Remover metade (250 μl) do meio MEM das culturas de CGC e retê-lo a 37 °C.
- Trate as células com meio MEM contendo 2 x LME (250 μl), ou seja, diluído 1:1 dando uma concentração de poço de 25 mM, ou com meio MEM pré-aquecido sem LME (250 μl) para culturas de controle.
- Incubar as células a 37 °C em atmosfera umidificada com 6% de CO2 por 1 hora.
- Lave as células duas vezes em meio MEM fresco pré-aquecido para remover o meio contendo LME e, em seguida, substitua o meio de cultura retido e um volume igual de meio MEM fresco pré-aquecido nos alvéolos correspondentes.
- Devolva as culturas à incubadora (umidificadas com 6% de CO2 a 37 °C) e deixe descansar por 24 horas antes de qualquer tratamento adicional.