O protocolo para a extração de tecido cerebral de filhotes de rato Sprague Dawley do dia 1, sacrificados por decapitação, foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Alberta.
1. Isolamentos de microglia e astrócitos
NOTA: Todos os meios para isolamento e cultura de células são pré-aquecidos a 37 °C em banho-maria. A solução salina balanceada de Hank (HBSS) tem 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Todos os meios de Eagle modificados de Dulbecco com a mistura de nutrientes F12 de Ham (DMEM/F12) são suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Apenas misturas com tripsina não têm FBS. Todos os materiais deste protocolo são estéreis (filtro, álcool, comprados e autoclavados) e todas as etapas subsequentes à etapa número 1.8 são realizadas em uma cabine de biossegurança com técnica asséptica.
- Por cérebro, pré-aqueça 15 mL de HBSS e 12,5 mL de DMEM/F12 a 37 °C em tubos de centrífuga cônicos de 50 mL e aproximadamente 2 mL de tripsina a 0,25% com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Aqueça mais 25 mL de DMEM/F12. Aqueça a tripsina cerca de 10 minutos antes do uso para evitar a perda de atividade enzimática.
- Despeje HBSS quente suficiente em placas de cultura estéreis de 6 e 10 cm para cobrir a superfície. Prepare um prato de 10 cm para cada dois cérebros mais um prato adicional de 6 cm.
- Coloque até 2 cérebros em cada prato de 10 cm2 (Figura 1A).
- Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça curva e reta para separar os córtices ao longo da linha média e o cerebelo com o tronco cerebral. Isso produz três seções de tecido por cérebro (Figura 1B).
- Descasque a camada fina e semitransparente (meninges) de tecido contendo vasos sanguíneos de cada seção de tecido e descarte, transferindo o tecido restante para uma placa de cultura separada. Segure as camadas finas expostas pelos cortes de tecido, com a pinça, e puxe cuidadosamente até que as partes principais estejam "penduradas" no tecido cerebral. Por fim, remova esta parte puxando suavemente. Consulte a Figura 1C-1E para imagens representativas de antes, durante e depois desta etapa.
- Em um gabinete de biossegurança, remova o HBSS restante da placa de cultura, retendo cuidadosamente o tecido. Macerar o tecido com bisturi e transferir o tecido para o tubo pré-aquecido de 15 mL com tripsina.
- Incubar este tubo durante 25 min num banho a 37 °C para digerir o tecido enzimaticamente.
- Centrifugue o tubo a 500 x g por 2 min em temperatura ambiente e despeje o sobrenadante.
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 10 mL de DMEM/F12 quente para inativar a tripsina e triturar a solução 5 vezes para quebrar o tecido.
- Centrifugue o tubo a 500 x g por 2 min em temperatura ambiente e despeje o sobrenadante.
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, ressuspenda o pellet em 10 mL de DMEM/F12 quente e transfira a solução para um tubo de centrífuga cônico de 50 mL.
- Usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 18, triture a solução 3 vezes.
- Distribua esta solução em incrementos de 12,5 mL de DMEM / F12 quente por cérebro.
- Pipete incrementos de 1 mL da solução triturada em uma placa de 12 poços (1 por cérebro).
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de células umidificada. Substitua a mídia após três dias e atualize a mídia a cada três dias subsequentes. Após 2 semanas, as células podem ser coletadas para experimentos.
2. Síntese de Macrômeros
- Pese 375 mg de sal de ácido hialurônico (HA) em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL e adicione 37,5 mL de água destilada.
- Lave a solução com um vórtice por 1 min e sonice a mistura até que pareça homogênea e perca sua viscosidade gelatinosa. Este processo pode levar 6 h.
- Transferir a solução para um copo de 100 ml com uma barra de agitação magnética (38 mm) e agitar vigorosamente à temperatura ambiente.
- Titular cuidadosamente o NaOH 5,0 M no AH de mistura e medir com papel de pH até que o pH se estabilize entre 8 e 12.
- Coletar 3 mL de anidrido metacrílico fresco (MA, 94%), coberto por nitrogênio durante o armazenamento.
nota: A MA é exposta à atmosfera por longos períodos (dias), perdendo sua reatividade.
cuidado: Todo o uso de MA deve ser feito em uma capela de exaustão.
- Adicione 200 μL de MA à solução de mistura de HA. A reação reduz o pH da solução abaixo de 8.
- Repita as etapas 2.4 a 2.6 até que os 3 mL de MA tenham sido adicionados à solução. Este processo pode levar até 1-2 h.
- Deixar a reação continuar durante a noite a 4 °C, sem misturar.
- Transferir a solução para 400 ml de etanol frio (EtOH) num copo de 500 ml e deixar precipitar durante 24 - 72 h a 4 °C.
- Transvasar cuidadosamente a maior parte da solução para um copo separado para eliminação e recolher o precipitado num tubo de centrifugação cónico de 50 ml. Isso pode ser distribuído em 2-4 tubos, se necessário.
- Centrifugue os tubos a 200 x g em uma centrífuga por 2 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
- Complete o tubo com EtOH frio, misture a solução com um vórtice por 1 min e repita as etapas 2.10-2.11.
- Adicione 25 mL de água deionizada estéril, misture a solução com um vórtice por 1 min, sonice (>20 kHz) por 1 h e incube a 4 ° C durante a noite.
- Colocar a solução num congelador a -80 °C durante 15 min ou até congelar ou congelar rapidamente em azoto líquido.
cuidado: Ao usar nitrogênio líquido, use luvas de proteção, protetor facial e avental.
- Liofilizar o tubo (abaixo de 0,1 mBar e -30 °C) durante 24 - 48 h até que seja produzido um pó semelhante à neve.
- Neste ponto, teste a pureza da amostra por meio de ressonância magnética nuclear de 1H, onde a quantidade de prótons de metacrilato (picos de 6,1 e 5,6 ppm), em relação aos prótons de metila (1,9 ppm), na estrutura de HA pode ser confirmada. Uma proporção mínima de 95% de metacrilato para prótons de metila é aceitável.
3. Formação de Gel e Encapsulamento 3D
- Preparação de lamínula e molde
- Faça uma solução aquosa destilada de 50 mL de metacrilato de propila 3-(trimetoxissilil) a 2% em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL.
- Colocar lamínulas de vidro de 18 mm em solução e agitar durante 1 h à temperatura ambiente. Até 50 lamínulas podem ser adicionadas de uma só vez.
- Enxágue as lamínulas mergulhando cada uma em série em 3 copos de 100 mL de água deionizada.
- Secar as lamínulas no vácuo a 40 °C durante a noite com um exsicador e uma estufa.
- Mergulhe rapidamente lamínulas individuais em 70% EtOH com pinça.
- Sem secar, coloque cada lamínula em um poço de uma placa de 12 poços.
- Lave e aspire cada poço com água deionizada estéril (1 mL por poço).
- Adicione 1 mL de 2 μg / mL de poli-L-lisina (PLL) estéril a cada poço e incube por >2 h.
- Aspire a solução PLL e deixe as lamínulas secarem ao ar.
- Mergulhe os moldes de polidimetil siloxano (PDMS) (veja a Figura 2) em 70% de EtOH e coloque um no centro de cada lamínula e deixe secar ao ar e criar uma vedação entre o molde e o vidro.
- Prepare moldes PDMS fundindo reagentes de pré-mistura PDMS na proporção de 10:1 em um prato de poliestireno de fundo plano. A quantidade de PDMS preparada é selecionada para produzir uma folha de aproximadamente 1 mm de espessura. Para formar poços no PDMS, corte as folhas com um punção circular com um diâmetro interno de 10.
- Preparação de células
NOTA: Todas as etapas do protocolo são realizadas com técnica estéril em uma cabine de biossegurança. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) é ajustada para pH 7,4 para todas as etapas.
- 24 h antes do encapsulamento celular em ácido hialurônico metacrilato (HAMA), atualize o meio para as culturas primárias de 2 semanas (da Etapa 1.15) nas placas de 12 poços. Adicionar 1 mL de meio DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) por alvéolo.
- Para cada placa de células de 12 poços, prepare 12,5 mL de tripsina diluída (0,25% de tripsina-EDTA diluída a 30% com meio DMEM/F12) e 25 mL de DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e aqueça a 37 °C em banho-maria.
- Colete o meio condicionado das placas usando uma pipeta sorológica de 10 mL (> 0,5 mL por poço), aspire completamente o líquido restante e substitua por 1 mL por poço de tripsina diluída (ácido tripsina-etilenodiaminotetracético a 0,075% [EDTA]) por 20-30 min em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2) até que a camada de células confluentes se desprenda da placa.
- Recupere o material da célula suspensa com uma pipeta de 1 mL (aparece como uma única peça flutuante) e colete em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Diluir com um volume equivalente de DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e centrifugar a 200 x g durante 2 min à temperatura ambiente, eliminando o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de DMEM/F12 quente (10% FBS e 1% PS), triture as células 5 vezes com uma pipeta de 10 mL e centrifugue a 200 x g por 2 min.
- Decantar o sobrenadante, ressuspender as células em 5 mL de DMEM/F12 quente e transferir as células para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
- Usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 18, triturar a solução celular 3 vezes e filtrar a suspensão através de uma peneira de célula de 40 μm em um novo tubo de centrífuga cônico.
- Colete 10 μL de suspensão celular, dilua 1:100 em DMEM/F12 quente e conte as células com um contador de células automatizado.
- Incubar em banho-maria a 37 °C até à fase de encapsulamento.
- Encapsulamento de células
NOTA: Todas as etapas do protocolo são realizadas com técnica estéril em uma cabine de biossegurança.
- Para cada placa de 12 poços de hidrogéis 3D, aqueça 12,5 mL de DMEM/F12 e 12,5 mL do meio DMEM/F12 condicionado coletado durante a preparação da célula.
- Pese a quantidade de HAMA necessária para uma concentração final de 0,5% em peso/vol. Dissolva este HAMA em PBS filtrado estéril a uma concentração de (2% em peso/vol); uma concentração 4 vezes maior que a concentração final é utilizada para acomodar a adição de células e outros reagentes. Uma placa de hidrogéis de 12 poços requer ~ 350 μL de PBS com 7 mg de HAMA.
- Sonicar (>20 kHz) até que o HAMA esteja totalmente dissolvido por 60 min.
- Prepare soluções individuais a 10% de trietanolamina (TEA) e 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP) e uma solução 1 mM de Eosina Y (EY) em alíquotas de 1 mL de PBS estéril pH 7,4.
- Para uma placa de 12 poços, faça uma mistura final de 1,4 mL de 1 x 107 células, 0,5% em peso/vol HAMA (350 μL de 2% em peso/vol), 0,1% TEA (14 μL de 10%), 0,1% NVP (14 μL de 10%) e 0,01 mM EY (14 μL de 1 mM) e 20% de mistura de lâmina basal (280 μL de estoque). O volume restante é PBS.
- Misture suavemente a solução e pipete 100 μL em cada molde PDMS com uma ponta de 1 mL.
- Exponha as amostras a uma luz LED verde de alta intensidade (~ 520 nm, 60 mW, em uma caixa fechada de 20 cm x 20 cm x 20 cm) por 5 min em temperatura ambiente.
- Adicione 1 mL por poço de DMEM/F12 condicionado a quente a uma placa de 12 poços.
- Segure cada lamínula entre o polegar e o indicador, retire lentamente o molde PDMS com uma pinça curva, tomando cuidado para não deslocar o gel e coloque-o em um poço com meio condicionado.
- Adicione mais 1 mL de DMEM/F12 quente a cada poço.
- Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2 por 2 semanas, atualizando o meio celular todas as semanas pipetando 1 mL de meio de cada poço e substituindo por 1 mL de DMEM/F12.
