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1. Cultura de células e preparação de reagentes
- Prepare placas revestidas para cultura de células.
- Dilua a solução de revestimento de matriz extracelular (MEC) com meio DMEM/F12 para preparar uma solução-mãe de 1 mg/mL. Alíquota da solução-mãe diluída de ECM em 30 tubos cónicos de 3 ml cada e conservar imediatamente a -20 °C. Para uma solução de trabalho, ressuspenda 3 mL de estoque de ECM em 33 mL de meio DMEM/F12 pré-resfriado, elevando o volume total para 36 mL para uma concentração de 80 μg/mL.
- Cubra 1 mL por alvéolo de uma placa de cultura de células de 6 poços com solução de trabalho ECM. Adicione mais 1 mL de DMEM/F12 por poço (se necessário) para garantir que a superfície do poço esteja totalmente coberta. Deixe as placas de cultura de células de 6 poços revestidas em temperatura ambiente por pelo menos 1 h antes de usar.
NOTA: As placas revestidas podem ser armazenadas na incubadora ou a 4 °C por até 2 semanas.
- Prepare formulações de meios, fatores de crescimento e pequenas moléculas.
- Para preparar 500 mL de meio de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), adicione suplementos 20x e 500x de acordo com as instruções do fabricante.
- Para preparar 500 mL de meio neural (MN), adicione heparina a uma concentração final de 2 mg/mL, 1x de solução antibiótica/antimicótica, 1x suplemento de B27 ou 1x suplemento de N2 a um frasco de 500 mL de DMEM/F12 com suplemento de L-glutamina conforme detalhado anteriormente.
- Para preparar uma solução estoque de 10 mM (1.000x) do inibidor da Rho-quinase Y27632 (Y), adicione 10 mg de pó em 3 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar, esterilizar, alíquota e armazenar a -20 °C. Utilizar a uma concentração de trabalho de 10 μM em meios.
- Para preparar uma solução estoque de 20 mM (10.000x) de SB431542, adicione 10 mg de pó em 1,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para preparar uma solução estoque de 2 mM (1.000x) de DMH1, adicione 10 mg de pó em 13,1 mL de DMSO. Filtre, esterilize, alíquota e armazene cada solução a -20 °C. Use cada uma em uma concentração de trabalho de 2 μM em meio (NM + SB431542 + DMH1).
nota: Este protocolo recomenda concentrações de trabalho de 2 μM de SB431542 e DMH1 com base em nossas observações e relatórios de outros afirmando que essa concentração promove efetivamente a indução neural de hPSCs. Concentrações mais altas também foram relatadas30. Além disso, com meios alternativos, também foi demonstrado que pequenas moléculas não são necessárias para alta conversão neural. Assim, as concentrações de trabalho variam dependendo dos ambientes alternativos de cultura de células, e as concentrações ideais devem ser testadas por pesquisadores individuais.
- Para preparar soluções individuais de 100 μg / mL (10.000x) de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF2), adicione 1 mg de cada um em 10 mL de PBS + 0,1% BSA. Alíquotas EGF e FGF2 armazenam soluções em alíquotas de 50 μL e armazenem a -80 °C. Use cada uma em uma concentração de trabalho de 10 ng/mL em meio; por exemplo, adicione 5 μL de EGF e 5 μL de FGF2 a 50 mL de NM (NM + EGF + FGF2).
- Para preparar uma solução de estoque de cloridrato de doxiciclina (Dox), primeiro dissolva o pó em DMSO a 100 mg / mL e armazene a -20 ° C. Além disso, dilua-o para fazer uma solução estoque de 2 mg / mL (1.000x) em PBS e armazene a -20 ° C. Use na concentração de trabalho de 2 μg / mL em meio; por exemplo, adicione 50 μL de Dox a 50 mL de NM (NM + Dox).
nota: Não volte a congelar as soluções após a descongelação.
2. Geração de Subtipos Neurais a partir de Células Pluripotentes Induzidas por Humanos (hPSCs)
NOTA: Todas as culturas de células devem ser mantidas em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C. Essas culturas são mantidas em níveis de oxigênio ambiente, embora níveis mais baixos possam ser utilizados.
- Gerar e manter progenitores de astrócitos (hAstros) a partir de hPSCs.
nota: Esta seção fornece um protocolo de diferenciação breve e simplificado. Para uma descrição detalhada (com formação do corpo embrióide, seleção de roseta e etapas de padronização regional), consulte o protocolo descrito anteriormente (Figura 1A, caixa verde pontilhada).
- Semeie aglomerados de hPSCs (Figura 1B) em placas de 6 poços revestidas com ECM (consulte a etapa 1.1) com 2 mL de meio hPSC + Y por poço. Alimente as células-tronco todos os dias até que estejam cerca de 50% confluentes e se dividam conforme necessário.
- Para dividir as hPSCs, adicione 1 mL de reagente de passagem aos poços e aspire após 1 min. Incube as células à temperatura ambiente por 5 min, adicione 1 mL de meio hPSC e divida os agregados 1:10 em novos poços revestidos com ECM em 2 mL de meio hPSC + Y por poço.
- Mantenha as células-tronco até que estejam cerca de 50% confluentes e, em seguida, mude o meio para NM + SB431542 + DMH1 para induzir a diferenciação neural (dia 0). Quando as células estiverem cerca de 95% confluentes, divida 1:6 em novos poços revestidos com ECM no mesmo meio.
- No dia 14, dissociar as células com a solução de descolamento e transferi-las para um frasco não revestido com Y para promover a formação de agregados.
nota: A adição de Y é utilizada para promover a sobrevivência celular e a formação de esferas, mas não é incluída durante todas as refeições.
- Para a geração de progenitores neuronais e neurônios (hNeurons), use essas células de dia 14 conforme descrito abaixo. Alternativamente, utilize essas células em pontos posteriores de culturas de monocamada ou esfera antes que ocorra a maturação neuronal ou o início da gliogênese.
nota: Por padrão, este protocolo produz astrócitos dorsais-corticais. No entanto, os subtipos de astrócitos podem ser especificados regionalmente pela adição de morfogênios padronizados, se desejado. O ácido retinóico (AR) pode ser adicionado para caudalizar as células em fenótipos da medula espinhal, enquanto o ouriço sônico (SHH), o agonista suavizado (SAG) ou a purmorlamina produzirão fenótipos ventrais.
- Para a geração de progenitores de astrócitos e astrócitos em agregados 3D formados espontaneamente (hAstrospheres), mude para NM + EGF + FGF2 e alimente semanalmente (ou conforme necessário para garantir um pH estável) conforme detalhado anteriormente.
- Dissocie suavemente os agregados hAstro com a solução de desprendimento quando aparecerem centros escuros e remova as esferas que se ligam espontaneamente. Quebre as esferas suavemente uma vez por semana para manter a integridade da esfera e evitar núcleos necróticos.
nota: Não exceda 5 min de tratamento com solução de descolamento.
- Após 4-6 meses de expansão, confirme a identidade celular e congele em meio de criopreservação (de acordo com as instruções do fabricante) ou condições alternativas de armazenamento para preservação a longo prazo em nitrogênio líquido ou use imediatamente para experimentação.
