Gerando esferas de co-cultura 3D de astrócitos e neurônios para induzir a formação de sinapses

Resumo

Fonte: Cvetkovic, C., et al. Modelagem de microcircuitos sinápticos com coculturas 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra um procedimento para co-cultivar os astrócitos e neurônios para formar esferas 3D. Essas esferas 3D fornecem uma plataforma distinta para examinar a formação de sinapses e a integração da rede neural, servindo assim como um modelo potencial para pesquisas em neurociência do desenvolvimento, doenças neurodegenerativas e intervenções neurofarmacológicas.

Protocolo

1. Preparação e manutenção de coculturas de esferas 3D

1. Dissocie hAstros de agregados 3D em suspensão.​
   1. Dissocie suavemente os agregados de astrócitos humanos (hAstro) com a solução de descolamento quando os centros escuros aparecerem e remova as esferas que se ligam espontaneamente. Quebre as esferas suavemente uma vez por semana para manter a integridade da esfera e evitar núcleos necróticos.
      NOTA: Não exceda 5 min de tratamento com solução de descolamento.
2. Dissocie hNeurons ou iNeurons de uma monocamada 2D.
   1. Remova o meio da placa de 6 poços e adicione 500 μL de solução de descolamento a cada cultura de monocamada contendo poço de hNeuron (neurônio humano) ou iNeurons (neurônios induzíveis). Incubar a 37 °C durante 5 min. Adicione suavemente 2-3 mL de meio basal DMEM/F12 para remover as células aderidas.
   2. Colete células e meios em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 300 x g por 1 min. Aspire o sobrenadante, adicione 1 mL de meio fresco e pipete para cima e para baixo suavemente com uma micropipeta de 1.000 μL para obter uma suspensão de célula única.
3. Forme esferas 3D usando placas de cultura de micropoços.
   1. Prepare a placa adicionando 0,5 mL de solução de enxágue antiaderente a cada poço da placa de micropoços. Placa de centrífuga a 2.000 x g por 5 min. Aspire a solução de enxágue, adicione 1 mL de meio basal DMEM/F12 a cada poço para lavar e aspire novamente.
      nota: Certifique-se sempre de que a centrífuga esteja equilibrada durante o uso.
   2. Conte cada tipo de célula usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado. Adicione a proporção desejada de hAstros e hNeurons ou iNeurons dissociados a cada poço em um volume total de 2 mL de meio neural (NM) + Y (inclua Dox se iNeurons forem utilizados). Centrifugar a placa a 100 x g por 3 min e retornar à incubadora.
      NOTA: As placas de micropoços de 24 poços (consulte a Tabela de Materiais) contêm 300 micropoços por poço. Adicionar um mínimo de 6 x 10⁵ células (para esferas de 2 x 10³ células cada) e um máximo de 6 x 10⁶ células (para esferas de 2 x 10⁴ células cada) em 2 ml de meio por alvéolo. Para esferas viáveis de uma densidade específica dentro desse intervalo, use uma quantidade definida de células e divida por 300 para calcular o número de células por esfera. Métodos e ferramentas alternativos de formação de esferas também podem ser utilizados, se desejado. Siga as instruções do fabricante para faixas aceitáveis de densidades de células.
   3. Permita que as células se automontem em esferas densamente compactadas dentro de placas de micropoços nos próximos 2 dias (Figura 1A). Substitua 50% do meio se a cultura estiver amarelando.
      nota: Troque apenas metade do meio e pipete suavemente ao remover e adicionar o meio para não perturbar as esferas. As esferas podem se levantar de micropoços e se fundir com força maior.
   4. Após 2 dias, remova suavemente as esferas dos micropoços com uma micropipeta de 1.000 μL (Figura 2D). Aplique levemente força no fundo dos micropoços com meio para remover quaisquer esferas aderidas adicionais. Deixe as esferas assentarem em um tubo cônico de 15 mL, aspire o meio antigo e adicione meio novo.
4. Configure o sistema de biorreator do frasco giratório para formar esferas 3D.​
   1. Limpe a superfície de uma placa de agitação magnética com etanol a 70% e coloque-a em uma incubadora de cultura de células. Frascos giratórios individuais em autoclave para esterilizar.
   2. Adicione esferas com um mínimo de 50–60 mL de mídia a cada frasco giratório (Figura 2D, inserção). Colocar o balão na placa de agitação magnética regulada para 60 rpm. Esferas de cultura em frascos giratórios até que estejam prontas para a coleta de dados.
      nota: É necessário um mínimo de 3 semanas em cultura para a formação de sinapses.

Resultados

Figura 1: Geração sistemática e reprodutível de esferas neurais 3D de bioengenharia. (A) As placas de cultura de micropoços (μ poços) são usadas para formar esferas neurais 3D de densidade desejada e proporções de neurônios para astrócitos de maneira sistemática e especificada pelo usuário, produzindo tamanho e forma consistentes. As imagens são mostradas 1 dia após a formação da esf...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 6 poços	Fisher Científico	08-772-1B
Tubos cônicos de 15 ml	Plásticos Olympus	28-101
Accutase	sigma	A6964-100ML	Solução de desprendimento
Placa AggreWell	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 34850
Solução de enxágue antiaderente	Tecnologias de células-tronco	Nº 7010	Impedir a adesão celular a placas de micropoços
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	Suplemento de mídia
Meio neuronal BrainPhys	Tecnologias de células-tronco	5790	Alternativa neurofisiológica do meio basal
DMEM/F12	Thermofisher	Rolamento 10565-042	Com suplemento GlutaMAX
DMH-1	Tecnologias de células-tronco	Nº 73634	PERIGO: Tóxico se ingerido. Concentração de trabalho: 2 uM
Soro de burro	Laboratórios Biológicos Lampire	Rolamento 7332100	Concentração de trabalho: 5% no tampão de bloqueio primário, 1% no tampão de bloqueio secundário
Cloridrato de doxiciclina (Dox)	sigma	D3072-1ml	PERIGO: Tóxico para mulheres grávidas. Concentração de trabalho: 2 ug/mL
Fator de crescimento epidérmico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentração de trabalho: 10 ng/mL
Fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF)	Peprotech	100-18B	Concentração de trabalho: 10 ng/mL
Hemacitômetro ou contador automático de células	Tecnologias da Vida	AMQAX1000
Matriz de membrana Matrigel	Corning	Rolamento 354230	Solução de revestimento ECM. Concentração de trabalho: 80 ug/ml. Prepare no gelo e certifique-se de que pipetas, tubos e meios sejam pré-resfriados.
Sistema MEA 2100	Sistemas Multicanal	MEA2100
Inibidor de Rho-quinase Y27632- (Y)	Tocris	1254	Concentração de trabalho: 10 uM
SB431542	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 72234	Concentração de trabalho: 2 uM
Frascos giratórios	Fisher Científico	4500-125
Frasco de cultura T25	Plásticos Olympus	25-207	Tampas ventiladas
Azul de tripano	Invitrogen	T10282