Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de culturas MSC de ratos
- Colheita de MSCs do fêmur
- Autoclave todas as ferramentas de dissecação (ou seja, tesouras de dissecação fina, tesouras de corte de ponta romba e pinças dentadas) a 180 °C por pelo menos 2 h antes do uso.
- Prepare o meio de crescimento MSC composto por meio essencial mínimo - modificação alfa (αMEM) suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (P / S, 1% v / v).
- Sacrificar ratos Sprague Dawley machos jovens (200-250 g de peso corporal) por overdose de pentobarbital (240 mg/kg de peso corporal, intraperitoneal).
nota: Amostras de medula de diferentes ratos devem ser processadas separadamente.
- Coloque os animais sacrificados em decúbito dorsal. Limpe bem o abdômen e os membros inferiores com etanol 70%.
- Remova a pele e o tecido subcutâneo sobre as coxas mediais usando uma tesoura de dissecação fina e uma pinça. Remova os músculos da coxa circunferencialmente até que o fêmur fique exposto. Continue proximal e distalmente até que as articulações do joelho e do quadril sejam vistas. Desarticule o fêmur através da articulação do quadril e joelho usando uma tesoura de corte de ponta romba.
nota: Não corte o fêmur para expor a cavidade da medula neste estágio. Transfira os fêmures intactos para uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar para processamento posterior.
- Use uma tesoura de corte de ponta romba para atravessar as extremidades distal e proximal do fêmur através da metáfise.
- Coloque um filtro de células de 70 μm sobre um tubo cônico de 50 mL. Insira uma seringa de 21 G, 10 mL contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) no canal femoral exposto e lave o conteúdo da medula no tubo cônico por lavagem repetida.
nota: Aproximadamente 20 mL de PBS são usados para lavar cada fêmur. Se a cor do conteúdo lavado permanecer manchada de sangue e turva, um volume maior pode ser usado.
- Recolha as células por centrifugação a 480 x g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio de crescimento MSC. Coloque as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm. Coloque as placas de cultura de tecidos em uma incubadora de células (37 °C, 5% CO2). Registre o dia inicial do revestimento como dia 0.
nota: Em todas as etapas que envolvem centrifugação, ajuste o freio para desaceleração máxima.
- Estabelecimento e expansão de colônias de CTM
nota: Este protocolo depende da adesão plástica de cultura de tecidos para selecionar MSCs de dentro da cavidade da medula. O conteúdo da medula óssea pode aderir ao plástico de cultura de tecidos por 2 dias.
- No dia 2, enxágue as placas de cultura três vezes com 10 mL de PBS para remover as células não aderentes. Substitua o PBS por 10 mL de meio de crescimento MSC após o enxágue. Lave as células com PBS e reabasteça-as com meio de crescimento MSC a cada 3 dias.
nota: As colônias de MSC devem ser visíveis no dia 6-7 (Figura 1A).
- Passe as células no dia 10, removendo o meio de crescimento e enxaguando as células com PBS. Adicione 1,5 mL de reagente de dissociação celular enzimática recombinante e incube a 37 ° C por 5 min. Adicione 3 mL de meio de crescimento MSC para neutralizar a reação. Recolha as células destacadas por centrifugação a 250 x g durante 5 min.
- Quantificar as células dentro do pellet usando um hemocitômetro após uma diluição apropriada em PBS.
- A semente passou células a uma densidade de 40.000 células/cm2 para uma placa de cultura de 10 cm em um meio de crescimento MSC.
nota: As MSCs de ratos devem atingir 80-90% de confluência dentro de 2 dias após a passagem (Figura 1B). As células podem ser passadas conforme descrito na etapa 1.2.2 para até 8 passagens. As CTMs podem ser caracterizadas por imunocitoquímica e sua capacidade de diferenciação de trilinhagens (Figura 2). Apenas as culturas de MSC entre as passagens 3 e 8 estão sujeitas a pré-condicionamento hipóxico subsequente e enriquecimento de progenitores neurais. As MSCs de maior número de passagens adotam uma morfologia achatada (Figura 1C) e não produzem progenitores neurais suficientes. Essas culturas devem ser descartadas.
2. Preparação de Culturas BMSC Humanas
- Diluir 1 mL de aspirado de medula óssea humana com 9 mL de meio de crescimento MSC e colocar as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm. Manter as culturas numa incubadora de células (37 °C, 5% CO2).
- Remova o meio após 2 dias e enxágue suavemente as culturas três vezes com 10 mL de PBS para remover as células não aderentes. Após o enxágue final, remova o PBS e substitua-o por 10 mL de meio de crescimento MSC. Reabasteça o meio de crescimento a cada 3 dias de cultura após o enxágue PBS.
nota: As colônias de MSC devem ser visíveis no dia 6-7. O número de colônias pode variar entre os indivíduos.
- Passe as células no dia 10, conforme descrito na etapa 1.2.2. Quantificar as células dentro do pellet usando um hemocitômetro após uma diluição apropriada em PBS. Semeie as células passadas com densidade de 40.000 células/cm2 em uma placa de cultura de 10 cm em um meio de crescimento MSC.
nota: As MSCs humanas (Figura 1D) demonstram uma morfologia semelhante às MSCs de ratos e devem atingir 80-90% de confluência dentro de 2 dias após a passagem. Devem ser caracterizados por imunocitoquímica e sua capacidade de diferenciação de trilinhagens. Tal como acontece com as MSCs de ratos, as MSCs humanas entre as passagens 3 e 8 estão sujeitas a pré-condicionamento hipóxico subsequente e enriquecimento de progenitores neurais.
3. Pré-condicionamento hipóxico
- Desmonte os componentes da câmara de hipóxia (ou seja, base, tampa, bandejas) após soltar o anel clamp e limpe as peças individuais com etanol a 70%. Coloque os componentes da câmara dentro de uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar para esterilização sob luz ultravioleta por 15 min.
- Antes do pré-condicionamento hipóxico, remova o meio e lave as culturas de MSC de ratos e humanos (seções 1 e 2) com 10 mL de PBS. Substitua o PBS por 10 mL de meio de crescimento MSC suplementado com HEPES 25 mM.
nota: As CTMs cultivadas em pratos de 10 cm devem ter atingido 80-90% de confluência antes de serem submetidas ao pré-condicionamento hipóxico.
- Coloque as placas de cultura dentro da câmara de hipóxia. Remonte os componentes da câmara e aperte o anel clamp. Lave uma mistura de gases de 99% N2/1% O2 na câmara a uma vazão de 10 L/min por 5 min.
- Sele as extremidades de conexão da câmara de hipóxia para garantir que não haja vazamento de gás. Colocar a câmara no interior da incubadora de células (37 °C, 5% CO2) durante 16 h.
- Após a conclusão do pré-condicionamento hipóxico, remova as culturas da câmara em preparação para a cultura de enriquecimento do progenitor neural subsequente.
4. Cultura de Enriquecimento de Progenitores Neurais
- Prepare o meio progenitor neural composto pelo meio de águia modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes de Ham F12 (DMEM/F12) suplementado com B27 (2% v/v), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF, 20 ng/mL), fator de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng/mL) e P/S (1% v/v).
- Separar as MSC hipoxicas pré-condicionadas de rato/humanos, conforme descrito no passo 1.2.2. Recolha as células destacadas por centrifugação a 250 x g durante 5 min. Quantificar as células dentro do pellet usando um hemocitômetro após diluição apropriada em PBS.
- Ressuspenda as células em meio progenitor neural e semeie em placas de 6 poços de baixa fixação a uma densidade de 6.000 células / cm2. Colocar a cultura numa incubadora de células (37 °C, 5% CO2) durante 12 dias. Reabasteça 75% do meio progenitor neural a cada 3 dias.
nota: Aglomerados de células não aderentes consideráveis devem ser observados nos dias 6-7. Nos dias 10-12, neuroesferas com diâmetro ≥ 100 μm podem ser observadas (Figura 3). As MSCs pré-condicionadas hipóxicas devem produzir mais neuroesferas do que as MSCs cultivadas em condições normóxicas.
- Colete as neuroesferas no dia 12, aspirando-as para uma pipeta de 10 mL e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as neuroesferas a 250 x g por 5 min.
nota: As neuroesferas podem ser caracterizadas no dia 12 para marcadores progenitores neurais, como nestina e GFAP.
5. Geração de células semelhantes a células de Schwann
- Prepare o meio de indução glial composto de αMEM suplementado com β-Heregulina (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) e P / S (1% v / v).
- Plaquear as neuroesferas preparadas na seção 4 em placas de 6 poços revestidas com PDL/laminina a uma densidade de 5-10 esferas por cm2 em 1,5 mL de meio de indução glial por poço. Substitua o meio de indução glial a cada 2 dias após enxaguar as células com PBS.
nota: As células das neuroesferas semeadas migram para fora no dia 2. No dia 7, as células migratórias têm uma aparência cônica e devem demonstrar imunopositividade para os marcadores de células de Schwann receptor de neurotrofina p75 (p75) e S100β. Essas células são chamadas de SCLCs.
