Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Resumo

Fonte: Tsui, Y, et al. Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação de SCLCs em células de Schwann.

Protocolo

Geração de células de Schwann comprometidas com o destino por meio de cocultura com neurônios DRG

1. Preparação de neurônios DRG de rato purificados

1. Autoclave todas as ferramentas de dissecção (ou seja, tesoura de dissecação, pinça, duas pinças de microdissecção e tesouras de microdissecação) a 180 °C por pelo menos 2 h antes do uso.
2. Cubra as placas de cultura de tecidos de 6 poços com poli-D-lisina (PDL, 10 μg/mL em PBS) a 4°C durante a noite. Remova o PDL e enxágue com 1.5 m de PBS por poço.
3. Prossiga com o revestimento das placas com laminina (10 μg / mL em PBS) a 37 ° C po....

Resultados

Figura 1: Estabelecimento de redes DRG de ratos purificados. As redes DRG purificadas são estabelecidas após o tratamento pulsado com os agentes antimitóticos FDU e uridina (A). As redes de neuritos desprovidas de glia endógena (B) que expressam S100β estão prontas para cocultura com SCLCs. Barras de escala = 100 μm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher científico	Rolamento 12400-024
Meio neurobasal	Thermofisher científico	Rolamento 21103-049
FBS	Biossoros	FB-1280/500
B27	Thermofisher científico	17504-001
Fator de crescimento epidérmico (EGF)	Thermofisher científico	PHG0313
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	Peprotech	100-18B/100UG
Fator de crescimento nervoso (NGF)	Millipore	NC011
Fator de crescimento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA)	Peprotech	100-13A
Heregulina beta-3, domínio EGF (β Her)	Millipore	01-201
Uridina	Sigmaaldrich	U3003
5-Fluro-2' - desoxiuridina (FDU)	Sigmaaldrich	F0503
Poli-D-lisina (PDL)	Sigmaaldrich	Pág. 7886-1G
Laminina	Thermofisher científico	23017015
GlutaMAX	Thermofisher científico	35050061
Penicilina / estreptomicina (P/S)	Thermofisher científico	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher científico	12604-013
Placa de 10 cm para cultura aderente	TPP	Rolamento 93100	Usado para seleção de MSCs por adesão à cultura de tecidos
Placa de 6 poços para cultura aderente	TPP	Rolamento 92006	Usado para expansão de MSCs após passagem
Placa UltraLow de 6 poços para cultura não aderente	Corning	3471	Usado para enriquecimento de progenitores neurais
Câmara de hipóxia	Billups-Rothenberg	MICROFONE-101
Buffer HEPES	Sigmaaldrich	H4034-100G