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1. Desenvolvimento das Micro-colunas de Hidrogel de Agarose
- Faça uma solução de agarose a 3% peso/volume (p/v) pesando 3 g de agarose e transferindo-a para um béquer estéril contendo 100 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Adicione uma barra magnética estéril ao copo e coloque-a na superfície de uma placa quente/agitador. Mantenha o copo coberto para evitar a evaporação de seu conteúdo na próxima etapa.
- Aquecer a agarose e a DPBS a uma temperatura de 100 °C e agitar a 60-120 rpm. Ajuste essas configurações conforme necessário e monitore constantemente a progressão do processo de dissolução à medida que a solução muda inicialmente de opaca para uma aparência clara que significa que a agarose foi completamente dissolvida.
cuidado: O copo quente e a solução estão quentes!
- À medida que a solução de agarose é aquecida e agitada, recupere quatro placas de Petri vazias de 10 cm e adicione 20 mL de DPBS a duas delas. Coloque agulhas de acupuntura (diâmetro: 300 μm, comprimento: 40 mm), tubos capilares de microlitros de vidro (diâmetro: 701,04 μm, comprimento: 65 mm, capacidade: 25,0 μL) e um dispensador de lâmpadas dentro do gabinete de biossegurança. Quando a solução líquida de agarose desaparecer, manter um aquecimento constante a cerca de 50 °C e agitar para evitar a gelificação da agarose.
- Introduza uma agulha de acupuntura na abertura inferior de um dispensador de lâmpada. Insira um tubo capilar sobre a agulha exposta ao exterior. Prenda o tubo capilar inserindo parte dele na seção de borracha do cilindro dispensador de lâmpada.
- Transfira 1 mL de agarose líquida com uma micropipeta para a superfície de uma placa de Petri vazia e coloque uma extremidade do tubo capilar verticalmente (com a agulha inserida) em contato com a agarose, enquanto a tampa de borracha do dispensador de bulbo está sendo comprimida para dentro. Libere lentamente a pressão na tampa do dispensador de bulbo para puxar a agarose para o tubo capilar.
nota: A transferência de agarose líquida para os tubos capilares deve ser realizada rapidamente. Se a agarose líquida for deixada esfriar na superfície da placa de Petri por tempo suficiente (aproximadamente 60 s), ela começa a gelificar, impedindo a sucção adequada da agarose ao longo do tubo capilar.
- Coloque cada conjunto bulbo-tubo-agulha em uma placa de Petri livre e deixe o gel de agarose dentro dos tubos capilares solidificar por 5 min. Puxe cuidadosamente o tubo capilar com as mãos para fora da rolha de borracha no cilindro dispensador de bulbo, deixando a agulha e o gel de agarose no lugar dentro do tubo.
- Extraia manualmente a agulha de acupuntura puxando-a lentamente para fora do tubo capilar; o cilindro de agarose recém-solidificado também desliza para fora do tubo neste procedimento, ainda ao redor da agulha. Empurre suavemente a microcoluna ao longo da agulha de acupuntura com a ponta de uma pinça estéril para movê-la até o fim. Coloque a agulha sobre uma placa de Petri aberta contendo DPBS e empurre a microcoluna para dentro do DPBS com uma pinça.
nota: Se a microcoluna de agarose permanecer dentro do tubo capilar de vidro após a remoção da agulha de acupuntura, empurre lentamente a microcoluna de agarose para fora do tubo capilar com uma agulha de calibre de 25 mm e para dentro do prato com DPBS.
- Esterilize microbisturis ou fórceps usando um esterilizador de esferas quentes. Faça 4% p / v de agarose pesando 4 g de agarose e transferindo-o para 100 mL de DPBS. Aqueça e mexa conforme explicado na etapa 1.2 para obter uma solução clara de agarose líquida a 4%. Mantenha o aquecimento e a agitação da solução durante as etapas a seguir.
- Transfira as placas de Petri contendo as micro-colunas para uma capela de dissecação e mova uma micro-coluna com pinças finas para uma placa de Petri vazia. Utilize o estereoscópio para orientação visual e um microbisturi para cortar as microcolunas no comprimento desejado. Apare ambas as extremidades para formar extremidades chanfradas em ângulos de 45o da horizontal para facilitar o manuseio das microcolunas durante a matriz extracelular (ECM) e a adição de células.
- Repita o passo anterior para mais três microcolunas na mesma placa de Petri e alinhe as quatro construções em paralelo com uma separação de <3 mm entre cada um dos cilindros. Carregue 50 μL de solução de agarose a 4% com uma micropipeta e despeje uma faixa / linha de líquido sobre a matriz de microcolunas para conectar e agrupar as construções em grupos de quatro (doravante chamados de "barcos de microcolunas"). Evitar o movimento de agarose a 4% para as extremidades das microcolunas, que podem entupir o interior, minimizando a distância entre as construções e adicionando a agarose rapidamente em uma linha fina.
nota: Organizar grupos de quatro micro-colunas em "barcos" não é necessário para fabricar os andaimes astrocíticos. No entanto, os barcos servem para acelerar o processo de fabricação e oferecer uma maneira mais segura de mover e manusear microcolunas em etapas posteriores.
- Deixe o barco de micro-coluna esfriar por 1-2 min para permitir a gelificação da agarose de 4% adicionada. Pegue o barco de microcolunas com pinças finas pela agarose de 4% de conexão e mova as microcolunas para a outra placa de Petri contendo DPBS preparada na etapa 1.1.3. Fabrique mais barcos com as micro-colunas restantes, conforme desejado.
- Mova as placas de Petri contendo as micro-colunas e/ou barcos para um gabinete de biossegurança e esterilize com exposição à luz ultravioleta (UV) por 30 min.
cuidado: Use proteção adequada para evitar a exposição aos raios UV.
- Conservar a loiça com os recipientes de microcoluna em DPBS a 4 °C, se a adição de ECM e o plaqueamento celular não ocorrerem imediatamente a seguir, até 1 semana. Repita as etapas de fabricação de microcolunas se as construções não forem usadas durante esse período.
2. Cultura e isolamento de células primárias
- Isolamento cortical de astrócitos de filhotes de ratos
- Em preparação para as etapas seguintes, adicione 20 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) a quatro placas de Petri de 10 cm que servirão como reservatórios para os tecidos dissecados. Mantenha todos os pratos no gelo. Esterilize tesouras cirúrgicas limpas, pinças, microespátulas e microbisturis em um esterilizador de esferas quentes.
- Pré-aqueça tripsina a 0,25% com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0,15 mg / mL de desoxirribonuclease (DNase) I em HBSS a 37 ° C. Além disso, pré-aqueça o meio de cultura de astrócitos a 37 ° C, que consiste no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com a mistura de nutrientes F-12 de Ham e 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Anestesie filhotes de ratos Sprague-Dawley pós-natais no dia 0 ou no dia 1, expondo-os a condições hipotérmicas e eutanasiando por decapitação. Prenda a cabeça em um estágio usando uma agulha de calibre 19 mm colocada no focinho anterior aos olhos.
- Faça uma incisão com um bisturi do meio posterior para anterior, da base do pescoço até logo atrás dos olhos. Faça outra incisão indo lateralmente diretamente atrás dos olhos para baixo, formando uma forma de T. Use uma pinça fina para puxar a pele craniana / crânio para o lado.
- Segure a cabeça pelo focinho (voltada para cima) colocando uma ponta da pinça na boca do animal e a outra na superfície externa. Remova o cérebro com uma microespátula estéril e coloque-o em uma das placas de Petri cheias de HBSS resfriado. Coloque esta placa de Petri no gelo imediatamente depois e em todos os momentos, exceto quando estiver em uso.
- Colocar um bloco de granito previamente armazenado a -20 °C abaixo de um estereoscópio dentro de uma capela de dissecação. Coloque a placa de Petri com o tecido cerebral na superfície do bloco de granito para preservar sua baixa temperatura durante o procedimento de dissecação. Use o estereoscópio como orientação visual ao longo das etapas a seguir.
- Se os bulbos olfatórios permanecerem intactos, extraia-os cortando com pinças ou microbisturis. Além disso, use um microbisturi para remover o cerebelo e fazer uma incisão na linha média separando os dois hemisférios cerebrais. Transfira os hemisférios com fórceps para uma placa de Petri contendo HBSS fresco e resfriado.
- Disseque as estruturas do mesencéfalo de dentro dos hemisférios com um microbisturi para obter apenas os córtices separados. Use uma pinça fina para descascar as meninges, uma estrutura semelhante a uma folha, do tecido cortical e transferir os córtices isolados para uma nova placa de Petri com HBSS frio. Use o microbisturi para picar o tecido a fim de aumentar a área de superfície para a ação da tripsina na próxima etapa.
- Use uma pipeta Pasteur para transferir os córtices para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de tripsina-EDTA pré-aquecido (8 córtices em cada tubo). Exponha o tecido cortical à tripsina-EDTA por 5-7 min a 37 ° C.
- Com uma pipeta Pasteur, remova cuidadosamente a tripsina-EDTA e adicione 400 μl de solução de DNAse I a 0,15 mg / mL ao tubo da centrífuga. Agite o tubo ou vórtice até que todo o tecido esteja dissociado e não haja restos de pedaços de tecido no líquido. Se não for possível dissolver completamente o tecido, remova os fragmentos restantes com a ponta de uma pipeta Pasteur.
- Centrifugar o tubo que contém a solução celular dissociada a 200 x g durante 3 min. Retirar o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur sem perturbar as células. Adicione 1 ml de meio de cultura de astrócitos (definido no passo 2.1.2) ao tubo com uma micropipeta e agite para ressuspender e criar uma solução homogénea.
- Transferir 10 ml de meio de cultura de astrócitos com uma pipeta serológica para um balão T-75. Adicionar 250 μl da solução de células de 1 ml (preparada no passo 2.1.11) com uma micropipeta ao balão para colocar um cérebro de critiúsculo em células por frasco. Distribuir uniformemente a solução celular descarregada pelo meio de cultura e agitar suavemente o balão para promover uma distribuição uniforme.
- Cultivar os frascos plaqueados numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO2. Depois de atingir 24 e 72 h em cultura, agitar mecanicamente o frasco para separar os tipos celulares não aderentes, como neurônios e oligodendrócitos.
- Depois, em cada um desses momentos, execute uma mudança de mídia. Segurar o balão na vertical de modo a que os meios de cultura fiquem no fundo do balão, não cobrindo as células aderidas. Aspirar o meio de cultura com uma pipeta de Pasteur, pressionando a ponta da pipeta contra o canto inferior do balão para evitar a extracção das células. Colocar o balão na posição horizontal original e adicionar suavemente 10 ml de meio astrócito sobre as células com uma pipeta serológica.
- Retorne os frascos à incubadora após cada troca de meio. Depois de atingir 90% de confluência, agite mecanicamente o frasco mais uma vez para remover quaisquer células não aderentes restantes.
- Passe os astrócitos retirando o meio de cultura com vácuo e uma pipeta Pasteur. Adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25% com uma pipeta sorológica sobre as células aderidas. Agite suavemente o frasco para garantir que a tripsina cubra todas as células e incube o frasco por 5-7 min a 37 ° C e 5% de CO2.
- Extinguir a tripsina adicionando 1 mL de meio astrócitos às células com uma pipeta sorológica. Extrair a solução celular do balão com uma pipeta serológica e transferi-la para um tubo de centrifugação estéril de 15 ml. Centrifugue o tubo a 200 x g por 3 min.
- Remover o sobrenadante com uma pipeta serológica e ressuspendê-lo em 1 ml de meio de cultura de astrócitos. Agite o tubo para garantir que a solução celular seja homogênea. Conte o número de células na solução com um hemocitômetro ou um contador automático de células.
nota: Um frasco 90% confluente normalmente produz aproximadamente 3 milhões de astrócitos.
- Adicionar 10 ml de meio de cultura de astrócitos a um balão T-75. Efectuar uma diluição de 1/4 transferindo 250 μl da solução celular (passo 2.1.18) com uma micropipeta para o balão T-75 que já contém o meio de cultura. Agitar suavemente para assegurar uma distribuição homogénea das células por toda a superfície do balão.
- Repita as etapas 2.1.16-2.1.19 cada vez que 90% de confluência for alcançada para passar pelas células.
- Isolamento de neurônios corticais de fetos de ratos
- Siga preparações semelhantes às etapas 2.1.1 e 2.1.2, com a exceção de que o meio pré-aquecido é um meio de co-cultura, consistindo em meio neurobasal + 2% de suplemento B-27 (para neurônios) + 1% de suplemento sem soro G-5 (para astrócitos) + 0,25% de L-glutamina.
- Eutanasiar ratos Sprague-Dawley embrionários grávidos cronometrados dia 18 com asfixia por dióxido de carbono e confirmar a morte por decapitação.
- Extraia os fetos de ratos e disseque os córtices do resto do tecido cerebral em placas de Petri contendo HBSS na superfície do bloco de granito resfriado, usando um estereoscópio para orientação visual e tesoura esterilizada, microbisturi e fórceps. Após a dissecção sucessiva das cabeças, cérebros, hemisférios cerebrais e córtices, transfira cada tecido para uma nova placa de Petri preenchida com HBSS.
- Pique o tecido cortical em fragmentos menores para aumentar a área de superfície da tripsina. Transfira 4-6 córtices com uma pipeta Pasteur para um tubo com 5 mL de tripsina-EDTA pré-aquecido e mantenha a 37 ° C para dissociar o tecido. Aos 5-7 minutos, agite manualmente o tubo para misturar e evitar a aglomeração do tecido.
- Remova o tubo de 37 °C após 10 min. Conforme explicado anteriormente no passo 2.1, extraia a tripsina-EDTA e substitua por 1,8 ml de solução de DNAse a 0,15 mg/ml. Em seguida, vórtice o tecido até que a solução pareça homogênea, sem fragmentos de tecido flutuando no líquido.
- Centrifugue a solução de tecido dissociado a 200 x g por 3 min. Após remover o sobrenadante, ressuspenda em 2 mL de meio de co-cultura. Conte o número de células nesta solução com um hemocitômetro ou um contador automático de células.
nota: O rendimento usual é de 3,0-5,0 x 106 células/hemisfério cortical.
- Preparar uma nova solução celular com uma densidade de 2,0-4,0 x 105 células/ml nos meios de co-cultura acima definidos.
3. Desenvolvimento dos cabos astrocíticos no interior das micro-colunas
- Fabricação de núcleos ECM
NOTA: O ECM deve ser adicionado ao interior das microcolunas de hidrogel no mesmo dia em que a semeadura celular será realizada.
- Dentro de um gabinete de biossegurança, prepare uma solução de 1 mg / mL de colágeno tipo I de cauda de rato em meio de co-cultura em um tubo de microcentrífuga estéril. Mantenha o tubo de microcentrífuga com a solução ECM no gelo o tempo todo, exceto quando estiver em uso.
- Transfira 1-2 μL da solução de ECM com uma micropipeta para uma tira de papel de tornassol para estimar seu pH. Adicione 1 μL de hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido clorídrico (HCl) 1 N com uma micropipeta para aumentar ou diminuir o pH da solução de MEC, respectivamente, e pipetar para cima e para baixo para homogeneizar. Verifique o novo pH com uma tira de papel de tornassol e adicione mais ácido ou base, conforme necessário, até que o pH esteja estável na faixa de 7,2-7,4.
- Mova as placas de Petri da etapa 1.2 para uma capela de dissecação e transfira 4-5 micro-colunas ou um barco com pinça fina estéril para uma placa de Petri vazia e estéril de 35 ou 60 mm. Usando o estereoscópio para orientação, posicione a ponta de 10 μL de uma micropipeta em uma extremidade de cada microcoluna e aspire para esvaziar o lúmen de DPBS e bolhas de ar. Confirme a ausência de bolhas de ar com o estereoscópio para garantir que o ECM adicionado na próxima etapa possa fluir livremente pelo lúmen.
- Carregue uma micropipeta P10 com solução de ECM, coloque a ponta de 10 μL contra uma extremidade das microcolunas de hidrogel e forneça solução suficiente para preencher o lúmen (aproximadamente 3-5 μL), observando a entrada de ECM com o estereoscópio. Pipetar um pequeno reservatório (2-4 μL) de solução de ECM em cada extremidade da microcoluna.
nota: Sempre gerencie 4-5 micro-colunas ou um barco de cada vez para evitar a secagem prolongada das construções, pois isso pode resultar no amassamento da estrutura da microcoluna. Micro-colunas completamente secas se fixam firmemente à superfície das placas de Petri, o que impede sua utilização para semeadura celular. Quantidades excessivas de meios de co-cultura (como medida de hidratação) não podem ser adicionadas às micro-colunas porque isso pode fazer com que o ECM flua durante o período de incubação descrito abaixo.
- Pipete o meio de cocultura em um anel ao redor da placa de Petri para fornecer um dissipador de umidade para evitar que as colunas sequem durante a incubação. Incubar a placa de Petri contendo as micro-colunas contendo ECM a 37 °C e 5% de CO2 por 1 h para promover a polimerização do colágeno antes de adicionar os neurônios e/ou astrócitos.
nota: O ECM deve formar uma camada que reveste a superfície interna do lúmen oco, em vez de um núcleo sólido de ECM abrangendo o interior, ambos os quais podem ser observados usando o estereoscópio. Se o ECM formar um núcleo, continue o período de incubação até que reste apenas a camada. Com essa camada formada, a solução de células de astrócitos pode preencher o interior da microcoluna nas etapas de revestimento.
- Durante o período de incubação, prepare a solução de células de astrócitos (conforme descrito abaixo).
- Semeadura de astrócitos e neurônios nas micro-colunas
- Passe os astrócitos banhados (entre a quarta e a décima segunda passagem) conforme explicado nas etapas 2.1.16-2.1.19. Depois de contar o número de células no frasco, preparar a solução celular a uma densidade de 9,0-12,0 x 105 células/ml de solução suspensa em meios de cultura de células.
- Usando um estereoscópio, coloque a ponta de uma micropipeta P10 em uma extremidade das microcolunas e transfira solução celular suficiente (~ 5 μL) para o lúmen para preenchê-lo completamente. Como feito acima com o ECM, adicione pequenos reservatórios de solução celular em ambas as extremidades de cada microcoluna.
- Incubar as microcolunas rebarbadas nas placas de Petri a 37 °C e 5% de CO2 durante 1 h para promover a fixação dos astrócitos à MEC. Se os neurônios não forem adicionados às microcolunas, prossiga para a etapa 3.2.5.
- Após o período inicial de incubação, adicionar 1-2 μL da solução de neurônios corticais obtida na etapa 2.2.7 em ambas as extremidades das microcolunas com uma micropipeta, observando sob o estereoscópio. Certifique-se de que haja meio suficiente nos pratos para evitar a secagem e incube novamente por 40 min a 37 °C e 5% de CO2 para permitir a adesão dos neurônios.
nota: A solução de neurônios corticais também pode ser adicionada 1-2 dias após a formação do feixe, executando a etapa 3.2.4 após remover cuidadosamente o meio de cultura da placa de Petri com uma micropipeta.
- Após o período de incubação, encher cuidadosamente as placas de Petri contendo as microcolunas plaqueadas com 3 ou 6 ml de meios de cocultura para placas de Petri de 35 ou 60 mm, respectivamente. Manter as microcolunas plaqueadas em cultura a 37 °C e 5% de CO2 para promover a automontagem dos feixes astrocíticos alinhados, que devem formar uma estrutura semelhante a um cabo após 6-10 h.