Desenvolvendo um modelo 3D baseado em seda e colágeno projetado de tecido neural polarizado

Abstract

Fonte: Chwalek, K. et al., Modelo 3D baseado em colágeno de seda projetado de tecido neural polarizado.J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo mostra a criação de um modelo de tecido neural polarizado em 3D utilizando andaimes de seda-colágeno. Ele detalha o processo de semeadura de células neuronais em andaimes de seda porosa, incubação para fixação celular, incorporação do andaime com colágeno e ressalta a importância da matriz de colágeno de suporte na formação de um modelo de tecido neural polarizado 3D.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação do andaime de seda

1. Preparação de solução de seda a partir de casulos de Bombyx mori
   1. Corte cada casulo em 8 pedaços iguais usando uma tesoura. Use cerca de 11 casulos para 5 g de casulos fragmentados. (15 min)
   2. Prepare 2 L de solução 0,02 M Na₂CO₃ e ferva usando uma placa quente. (15 min)
   3. Pesar 5 g de casulos fragmentados e fervê-los em solução de Na₂CO₃ por 30 min. Mexa a seda fervente a cada dois minutos com uma espátula. Esta etapa, chamada de degomagem, purifica a fibroína da seda de proteínas hidrofílicas, sericinas. (30 minutos)
   4. Torça a fibroína com a mão e enxágue-a em água destilada pelo menos três vezes para remover qualquer sericina e produtos químicos restantes. (5 min)
   5. Coloque a fibroína úmida em uma placa de Petri e seque o extrato de fibroína na coifa de fluxo O/N.
   6. No dia seguinte, pesar a massa seca de fibroína e colocá-la num copo de vidro. (15 min)
   7. Para dissolver a fibroína em solução de 9,3 M LiBr, calcule o volume necessário (em ml) de LiBr multiplicando a massa de fibroína seca por 4. Despeje lentamente a solução de LiBr sobre a fibroína de seda e use uma espátula para mergulhar todas as fibras de fibroína. Cubra o béquer para evitar a evaporação e coloque-o a 60 °C por 4 horas para permitir que as fibras se dissolvam. (15 min)
   8. Usando a seringa, colete a solução de fibroína do béquer e carregue-a nos de diálise MWCO 3.500. Faça diálise contra água destilada por 48 horas. Troque a água a cada duas horas.
   9. Usando a seringa, colete a solução de fibroína dos em tubos cônicos de 50 ml e centrifugue duas vezes a 9.000 rpm (~ 12.700 x g) a 4 ° C por 20 min. Após cada etapa de centrifugação, despeje o sobrenadante em um tubo novo e descarte o pellet. (40 min)
   10. Meça a concentração da fibroína estimando o peso seco. Despeje 1 ml de solução de seda em um recipiente de pesagem. Seque a amostra na estufa a 60 °C durante 2 horas. Pesar a fibroína de seda seca e calcular a concentração da solução de fibroína de seda multiplicando o peso obtido por 100. A concentração esperada de solução de seda é de 6-9% (p / v).
   11. Ajustar a concentração de seda para 6% (p/v) diluindo-a em água destilada.
       Ponto de parada: A fibroína de seda líquida pode ser armazenada a 4 °C por até um mês em um recipiente fechado.
2. Preparação de andaimes porosos a partir de solução de seda.
   1. Peneire o NaCl granular para separar os grânulos de 500-600 μm, que serão usados em etapas posteriores. Rejeitar os granulados com dimensões inferiores a 500 μm e superiores a 600 μm. (15 min)
   2. Despeje 30 ml de solução de seda a 6% no molde de politetrafluoretileno (PTFE) (Figura 1). Espalhe delicadamente 60 g de NaCl peneirado sobre a seda. Bata no recipiente para obter uma camada uniforme de sal. Incubar 48 horas em RT para polimerizar a seda.
   3. Coloque o molde de PTFE contendo andaime no forno a 60 °C por 1 hora para finalizar a polimerização e evaporar qualquer líquido restante.
   4. Coloque o conteúdo do molde de PTFE em um béquer contendo 2 L de água destilada por 48 horas para lixiviar o sal. Troque a água 2-3 vezes por dia. Remova os andaimes de esponja dos moldes quando o sal estiver completamente lixiviado.
      Ponto de parada: As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 °C em um recipiente fechado para evitar a desidratação dos andaimes.
   5. Corte os andaimes com um punção de biópsia de 5 mm de diâmetro quando estiver pronto. Pré-corte os andaimes para atingir cerca de 2 mm de altura. Perfure o centro do andaime com o punção de biópsia de 2 mm de diâmetro (Figura 2A). (1 hora)
   6. Autoclave os andaimes imersos em água para esterilizá-los (ciclo úmido, 121 °C, 20 min).
      Ponto de parada: As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 °C em um recipiente fechado para evitar a desidratação dos andaimes.
   7. Antes da semeadura celular planejada, mergulhe os andaimes em uma solução estéril de poli-D-lisina (PDL) a 0,1 mg / ml. Incubar durante 1 hora a 37 °C.
   8. Lave os andaimes 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o PDL não ligado. (30 minutos)

2. Isolamento de neurônios corticais de ratos

1. Dissecar córtices de ratos Sprague-Dawley embrionários do dia 18 (E18) após a obtenção do protocolo animal aprovado. (2 horas)
2. Incubar 10 córtices em 5 ml de tripsina a 0,25% com DNase I a 0,3% (do pâncreas bovino) por 20 min a 37 °C.
3. Inative a tripsina adicionando 1 mg/ml de proteína de soja.
4. Triturar os córtices com uma pipeta Pasteur de 10 ml, pipetando 20 vezes para cima e para baixo até obter uma suspensão de célula única. Seja gentil e evite a formação de bolhas de ar. (10 min)
5. Centrifugue a suspensão celular a 127 x g por 5 min.
6. Ressuspenda o pellet celular em 10 ml de meio de cultura (meio neurobasal, 1x suplemento B27, 1x Glutamax, 1% de penicilina/estreptomicina). Conte as células. A concentração celular esperada é de cerca de 2x10⁷/ml. (20 min)

3. Construa Assembléia e Cultura

1. Semeadura de andaime com células
   1. Mova os andaimes estéreis e todos os utensílios necessários dentro de uma capa de cultura de células. Coloque os andaimes em uma placa de cultura de células de 96 poços usando uma pinça estéril, alocando um andaime por poço. (10 min)
   2. Mergulhe os andaimes no meio de cultura celular para equilibrá-los antes da semeadura celular. Incubar durante 1 hora a 37 °C. (10 min)
   3. Aspire o excesso do meio dos andaimes.
   4. Aplicar 100 μl de suspensão celular/andaime. (10 min)
   5. Incubar as células a 37 °C O/N para permitir a fixação das células ao andaime.
   6. Na manhã seguinte, aspirar as células não aderidas e aplicar 200 μl/alvéolo de meio de cultura fresco. (10 min)
2. Incorporação de andaimes com matriz de colágeno. (2 horas)
   1. Coloque 10x PBS, água, 1 N NaOH e colágeno I de cauda de rato no gelo. Prepare uma solução de trabalho de colágeno de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha no gelo até que as construções semeadas por células estejam prontas (até 1 hora).
   2. Remova as construções de seda semeadas por células da incubadora e aspire o excesso de meio.
   3. Transferir os andaimes para os alvéolos vazios na placa do poço utilizando uma pinça estéril e imergir cada andaime em 100 μl de solução de colagénio a 3 mg/ml. Coloque a placa de cultura de tecidos de volta na incubadora por 30 min para permitir a polimerização do colágeno.
   4. Aplicar 100 μl de meio de cultura celular pré-aquecido/poço. Cultive os construtos por uma semana, mudando o meio todos os dias, substituindo apenas metade do volume do meio.

Results

Figura 1. Molde de PTFE usado para preparação de andaimes de esponja de seda. As dimensões: 10 cm de diâmetro, 2 cm de altura.

Figura 2. 3D modelo de tecido semelhante ao cérebro. (A) Andaime de esponja de seda porosa. (B) Coloração v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrífuga 5804 R	Eppendorf
poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	Pág. 6407-5MG	Concentração final 10 μg/ml, dissolvida em água
Meio neurobasal	Gibco	21103049	aquecer até 37 °C antes de usar
Suplemento B27 50x	Gibco	Rolamento 17504-044
Glutamamax	Gibco	Rolamento 35050-061
Penicilina estreptomicina	Corning	30-002-CI
Colágeno I, cauda de rato, 100 mg	Corning	354236	Concentração final 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosivo
Pbs	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Na2CO3	Sigma-Aldrich	Rolamento 223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
para diálise MWCO 3500	Thermo Fisher	Nº 66110
Placa de aquecimento	Fisher Científico	Isotemp
peneira	Fisher Científico	Nº 270, Nº 35, Nº 30
Ptfe			molde feito em casa (Figura 1) 10 cm de diâmetro, 2 cm de altura
NaCl	Sigma-Aldrich	Rolamento 71382
Punção de biópsia 5 mm	Instrumento de precisão mundial	501909
Punção de biópsia 2 mm	Instrumento de precisão mundial	501908
tripsina	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	concentração final 0,3%
Proteína de soja	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	Concentração final 1 mg/ml