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1. Período de diferenciação antes da recolocação
- Diferencie os neurônios em placas de 10 cm, usando um protocolo de escolha, até que os neurônios tenham formado uma rede espessa com seus processos e expressem não apenas marcadores neuronais iniciais, como MAP2 ou TuJ1, mas também marcadores tardios, como NeuN.
- Troque metade do meio de escolha a cada 4 dias durante o processo de diferenciação neuronal.
nota: Mudanças médias mais extensas ou frequentes diluem fatores tróficos essenciaisaq e podem desfavorecer a maturação.
- Para os neurônios WT126 derivados de iPSC, use os seguintes meios de cultura pós-diferenciação: 5 mL de suplemento 100x N2 (neural), 10 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), 10 ng/mL de fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), 1 μg/mL de laminina, 200 μM de ácido ascórbico, 1 μM de dibutiril-cAMP e 10 mL de SM1 para 500 mL de meio de Dulbecco modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, usando mudanças de meio de meio, substitua por meio basal neural (Tabela de Materiais) e os mesmos suplementos.
- Para as células-tronco pluripotentes induzidas ou neurônios CVB WT derivados de iPSC, use o seguinte meio de cultura pós-diferenciação: 500 mL de meio neural basal A (Tabela de Materiais) e 500 mL de meio DMEM/F12 com 2 μg/mL de laminina, 10 mL de suplemento de glutamina (Tabela de Materiais), 0,75 mg/mL de bicarbonato de sódio, 5 mL de aminoácidos não essenciais mínimos do meio essencial (MEM), 0,2 mM de ácido ascórbico, 10 ng/mL de BDNF, 20 mL de suplemento 50x B27 e 10 mL de 100x N2.
2. Revestimento de multipoços
- No dia anterior ao reforço, cubra com poli-L-ornitina (PLO). Dissolva o PLO em água estéril para fazer uma solução estoque (10 mg / mL). Armazene este estoque a -20 °C. Dilua o PLO 1:100 em água para obter uma concentração de 50 μg/mL ao revestir vidro e proporção de 1:1.000 (10 μg/mL) ao revestir plástico.
- Aplique o revestimento diretamente nas placas-alvo. Use o volume de revestimento apropriado ao tamanho da placa (ou seja, para uma placa de 24 poços, aplique 500 μL de solução de PLO por poço).
- Deixe os pratos ficarem no escuro durante a noite em temperatura ambiente.
- Recupere as placas revestidas no dia da repintura e transfira para um gabinete de biossegurança estéril.
- Aspire a solução de OLP e enxágue duas vezes com água estéril.
- Diluir a laminina (1,15 mg/mL) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na diluição de 1:400.
nota: Descongele a laminina a 4 ° C e adicione rapidamente ao PBS para evitar a agregação de laminina e revestimento irregular.
- Aspirar água estéril e aplicar 500 μL de revestimento de laminina em poços previamente revestidos com PLO.
- Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C por um mínimo de 4-6 h. Use incubações mais longas, até 16 h, para superfícies de vidro. Use tempos de incubação consistentes.
3. Replating de neurônios diferenciados
- Enxágue a placa de neurônios diferenciados com PBS uma vez suavemente. Disperse o PBS suavemente pela parede da placa, e não diretamente nas células, para evitar rompê-las.
- Aspire suavemente o PBS, tomando cuidado para evitar tocar diretamente nas células, mas aspirar da borda do prato enquanto o inclina em direção ao pesquisador.
- Aplicar um mínimo de 1 ml da enzima proteolítica (Tabela de Materiais) por placa de 10 cm e devolver as células à incubadora. Adicione volumes ligeiramente maiores se a sala de cultura de tecidos apresentar uma alta taxa de evaporação devido à baixa umidade.
- Incubar células com enzima proteolítica por 40-45 min para separá-las da placa e separá-las de outros neurônios dentro da rede neuronal.
nota: O tempo nesta etapa é crítico. Extinguir a protease muito cedo pode levar ao aumento da morte celular após o replaqueamento. O fabricante da enzima proteolítica recomenda que temperaturas muito inferiores a 37 ° C sejam usadas com períodos de incubação mais longos para linhas celulares em passagem (por exemplo, durante a noite a 4 ° C). No entanto, o manuseio de neurônios a 4 ° C deve ser evitado, pois eles geralmente apresentam baixa sobrevivência após a exposição ao frio. O fabricante também afirma que uma incubação de 60 minutos com a enzima a 37 °C leva à sua inativação enzimática. No entanto, na experiência dos autores, uma incubação de 40-45 minutos de culturas neuronais derivadas de hiPSC a 37 ° C é suficiente para uma dissociação eficiente e excelente sobrevida neuronal após a replatinação.
- Verifique os neurônios em um microscópio de contraste de fase durante o tempo de incubação e permita que o tratamento com protease continue até que a rede neural se desprenda completamente da placa e comece a se quebrar em folhas menores ao sacudir brevemente a placa sob o microscópio.
- Extinguir a atividade da protease utilizando 5 ml de meio DMEM fresco por 1 ml de protease na placa de 10 cm para interromper a digestão. Triture suavemente as células contra a placa 5-8 vezes para interromper a rede, usando pipetas sorológicas. Tenha cuidado para não aplicar muita pressão ao triturar, pois os neurônios diferenciados são frágeis. Não use uma ponta P1000, pois a extremidade é muito afiada e estreita e, portanto, pode ser cortada ou danificada pelos neurônios.
- Aplique a solução com células através de um filtro de células com malha de 100 μm de diâmetro em um tubo cônico fresco de 50 mL gota a gota.
- Enxágue o filtro com mais 5 mL de meio DMEM fresco, após a filtragem das células.
- Gire as células em uma centrífuga de bancada a 1.000 x g por 5 min.
- Retorne o tubo cônico ao gabinete de biossegurança e aspire a maior parte do meio, deixando cerca de 250 μL para garantir que as células retenham a umidade.
- Ressuspenda as células suavemente em 2 mL de meio DMEM fresco. Não pipete o pellet contra a lateral do tubo. Em vez disso, inverta suavemente o tubo cônico 2-3 vezes e passe as células pela extremidade de uma pipeta sorológica de 5 mL para desalojá-las.
- Aplique 10 μL de neurônios ressuspensos na borda de um hemocitômetro.
- Adicione 8-10 μL de azul de tripano à gota de células para avaliar a viabilidade celular durante esta etapa de ressuspensão. Aplique 10 μL desta mistura no hemocitômetro ou em outros contadores automáticos de células. Avaliar como viáveis as células que são brilhantes em fase e excluir o corante azul de tripano.
- Determine a quantidade de células viáveis / mL e prepare-se para diluir o conteúdo do tubo cônico de acordo com a densidade celular desejada.
- Placa ~ 10.000 células por poço para uma placa de 384 poços; placa ~ 150.000-200.000 células por poço para uma placa de 24 poços.
- Adicionar DMEM fresco ao tubo cónico das células ressuspensas para obter uma diluição adequada e adicionar suplementos adicionais adequados, tais como B27 e/ou BDNF, dependendo das necessidades da linhagem celular específica.
- Incline suavemente o tubo cônico para misturar 2-3 vezes.
- Aspire o revestimento de laminina da placa de 24 poços ou da placa multipoços de 384 poços usando uma pipeta de 16 canais e enxágue uma vez com PBS.
- Aspire PBS usando um P1000 para a placa de 24 poços ou a pipeta de 16 canais para placas de 384 poços.
- Aplique a solução celular em cada poço em um movimento em forma de oito para evitar aglomeração. A uniformidade do revestimento também pode ser otimizada usando dispositivos automatizados de manuseio de líquidos.
nota: A adição de laminina ao meio a partir de 2 a 4 dias após o replaqueamento também ajuda a manter uma distribuição homogênea das células.
- Repita as etapas 3.19 e 3.20 para cada poço.
- Retorne a placa à incubadora, regulada para 37 °C e 5% de dióxido de carbono.
- Após 2 dias, comece a trocar metade do meio a cada 4 dias usando os meios de cultura de pós-diferenciação descritos na seção 1.2.