$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fabricação de moldes SU-8 por fotolitografia
NOTA: Este procedimento envolve produtos químicos perigosos. Use capela e EPI por toda parte.
- Limpe o wafer de silício (4 polegadas de diâmetro, 1 mm de espessura, polido) com acetona e sopre com gás nitrogênio. Em seguida, leve ao forno a 180 °C durante 3 min para secar.
- Dispense 3 mL de SU-8 2100 em um wafer limpo.
- Cubra o SU-8 uniformemente no wafer usando um revestidor de rotação a 500 rpm por 10 s e, em seguida, gire sequencialmente a 1500 rpm por 30 s com uma aceleração de 300 rpm / s para obter uma camada de 150 μm de espessura de SU-8.
NOTA: Certifique-se de que o wafer de silício esteja posicionado no centro do revestidor giratório e fixado corretamente por vácuo.
- Asse suavemente o wafer na placa quente a 50 °C por 10 min, a 65 °C por 7 min e a 95 °C por 45 min.
- Ajuste a fotomáscara (Figura 1) para o alinhador de máscara e exponha a luz UV (365 nm) por 60 s.
NOTA: O tempo de exposição precisa ser otimizado por uma dose apropriada de luz UV.
- Após a exposição, cozer o wafer a 65 °C durante 6 min e a 95 °C durante 13 min na placa de aquecimento.
- Desenvolver o wafer por 10-20 min em revelador SU-8 com agitação usando um agitador orbital, trocando a solução reveladora uma vez durante o processo.
NOTA: Estenda o tempo de revelação quando os detritos do SU-8 permanecerem.
- Enxágue o wafer em isopropanol e seque suavemente o wafer com gás nitrogênio.
- Meça a altura do SU-8 depositado por um microscópio de medição e certifique-se de que tenha aproximadamente 150 μm de espessura. Pode ser armazenado indefinidamente em temperatura ambiente.
2. Fabricação de chips de cultura de tecidos à base de microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Fixe o wafer depositado com SU-8 em um recipiente (por exemplo, placa de Petri de plástico de 15 cm) com fita dupla-face.
- Sopre a poeira do wafer usando gás nitrogênio.
- Para silanizar, coloque o wafer depositado com SU-8 em uma câmara de vácuo junto com um pequeno recipiente (por exemplo, prato de 35 mm). Coloque 10 μL de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorossilano no recipiente pequeno. Não aplique diretamente o (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorossilano ao wafer SU-8.
- Feche bem a câmara de vácuo e ligue uma bomba de vácuo por pelo menos 2 h.
- Pegue um copo de plástico e despeje o elastômero de silicone (por exemplo, Silpot 184 ou equivalente, Sylgard 184) e o agente de cura em uma proporção de peso de 10:1. Em seguida, misture bem usando uma espátula e desgaseifique na câmara de vácuo até que as bolhas sejam totalmente removidas.
- Despeje a mistura PDMS no recipiente com o wafer SU-8 até a espessura desejada (3-4 mm) e desgaseifique novamente para remover as bolhas.
- Asse o PDMS em um forno a 60 ° C por pelo menos 3 horas para curar completamente o PDMS.
- Após o resfriamento, corte o PDMS curado do wafer usando um bisturi ou uma lâmina de barbear.
- Para criar as duas câmaras do chip de cultura de tecidos, faça dois orifícios onde os dois compartimentos estão localizados usando um punção de biópsia de 1,5 mm de diâmetro.
- Para criar um reservatório médio, prepare outra mistura de PDMS (elastômero de silicone e o agente de cura na proporção de peso de 10:1) e despeje-a em uma nova placa de Petri de 10 cm. Ajuste o volume de vazamento para 5 mm de espessura do PDMS.
- Asse o PDMS em um forno a 60 ° C por pelo menos 3 horas para curar completamente o PDMS.
- Depois de resfriar o PDMS, corte o PDMS curado com um bisturi para obter um anel retangular.
- Cole a camada inferior com o reservatório médio aplicando PDMS não curado entre eles e assando as camadas de PDMS montadas. Essa estrutura colada resulta no chip de cultura de tecidos PDMS.
- Limpe o chip de cultura de tecidos PDMS com fita adesiva para remover poeira e pequenas partículas da superfície. Os chips de cultura de tecidos PDMS podem ser armazenados em temperatura ambiente se protegidos contra poeira e UV.
3. Preparação da cultura
- Meio de cultura
nota: Todos os meios listados abaixo devem ser filtrados para esterilização, salvo indicação em contrário. Os meios preparados podem ser armazenados a 4 °C e utilizados no prazo de um mês.
- Para preparar o meio mTeSR Plus: combine um frasco de 100 mL de suplemento mTeSR Plus 5x com um frasco de 400 mL de mTeSR Plus Basal Medium.
- Para preparar 100 mL de meio KSR: Em 85 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium ou DMEM/F12, adicione 15 mL de reposição de soro Knockout (KSR, 15%), 1 mL de suplemento comercial de glutamina (1%) e 1 mL de aminoácido não essencial (NEAA, 1%).
- Para preparar 100 mL de meio N2: Em 100 mL de meio neurobasal, adicione 1 mL de N2 (100x), 1 mL de suplemento comercial de glutamina e 1 mL de NEAA.
- Para preparar 250 mL de meio de maturação: Em 250 mL de meio neurobasal, adicione 5 mL de B27 (2%), 2,5 mL de suplemento comercial de glutamina (1%) e 2,5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).
- Ressuspenda os compostos (ácido retinóico (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) em DMSO para cultura de células até a concentração desejada. Preparar alíquotas e conservá-las a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. As seguintes soluções de estoque são usadas: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Revestimento
nota: Para evitar a polimerização da matriz da membrana basal pelo calor, evite ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento. Manuseie todos os procedimentos de revestimento com ponteiras e tubos de pipeta pré-resfriados, se possível. A matriz da membrana basal deve ser descongelada durante a noite a 4 °C e aliquotada usando pontas e tubos de pipeta pré-resfriados. As alíquotas podem ser congeladas a -20 °C ou -80 °C.
- Descongele a alíquota congelada a 4°C no gelo. A alíquota deve ser mantida fria durante o processo de revestimento. Usando uma ponta de pipeta pré-resfriada, dilua a matriz da membrana basal com DMEM/F12 gelado na proporção de 1:40. A matriz de membrana basal diluída não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C por 2-3 dias, desde que não tenha ocorrido polimerização.
- Adicione 1 mL da solução de matriz de membrana basal/DMEM-F12 para revestir um poço da placa de 6 poços.
- Incubar a placa à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora, ou 4 °C durante a noite. As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por no máximo uma semana.
4. Manutenção de células iPS
- Prepare pratos revestidos com matriz de membrana basal conforme mencionado anteriormente na etapa 3.2.
- Aspirar totalmente o meio mTeSR Plus. Lave o poço uma vez com PBS e adicione 0,5 mL de reagente de passagem (consulte a Tabela de Materiais). Aguarde alguns segundos e aspire a solução.
- Incubar a placa a 37 °C na incubadora durante 5 min ou até que as células se tornem redondas.
nota: O tempo de incubação pode variar entre diferentes linhagens celulares iPS e a confluência. Verifique periodicamente ao microscópio para determinar o tempo de dissociação durante a incubação.
- Adicione 1 mL de meio mTeSR Plus e bata na placa por 30-60 s para separar as colônias.
- Misture suavemente 1 mL da solução de suspensão celular com 7 mL de mTeSR fresco mais meio. Não pipetar mais de 5 vezes.
- Placa na proporção de 1:8. Normalmente, adicione 1 mL da suspensão da etapa 5.5 e adicione 1 mL de mTeSR mais meio suplementado com 5-10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK). A razão de diluição de passagem depende da linha iPSC.
- Colocar a célula numa incubadora a 5% de CO2/37 °C. No dia seguinte, remova o Y-27632 adicionando um novo meio mTeSR Plus. Depois disso, troque de meio a cada dois dias inicialmente e todos os dias à medida que a célula atingir uma confluência mais alta.
5. Diferenciação de células iPS em neurônios motores
- IPSC de passagem para diferenciação de neurônios motores
nota: A diferenciação pode ser conduzida com sucesso no protocolo 3D (5.2).
- Permita que células iPS indiferenciadas cresçam até atingirem uma confluência de aproximadamente 80% em meio mTeSR Plus em uma placa de 6 poços.
- Aspirar completamente o meio. Lave imediatamente o poço uma vez com PBS estéril e adicione 0,5 mL de solução de dissociação celular às células.
- Incubar a placa a 37 °C na incubadora durante cerca de 2-3 minutos ou até que as células se separem e fiquem redondas, mas permaneçam ligadas ao poço.
- Adicione 1 mL de meio e pipete suavemente para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL consistindo em 4 mL do meio.
- Centrifugue a 200 x g por 3 min.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet intacto, e ressuspenda as células em 1 mL do meio suplementado com 10 μM de Y-27632.
- Conte as células usando um hemocitômetro e prossiga para 5.2 (diferenciação 3D).
- Formação de esferóide de neurônio motor (MNS) na diferenciação 3D ("protocolo 3D")
nota: Uma mudança completa do meio é feita diariamente dos dias 0 a 12 de diferenciação (Figura 2).
- Semeie as células iPS da etapa 5.1.7 para uma placa inferior U de 96 poços a 40.000 células/poço em 100 μL de mTeSR Plus suplementado com 10 μM de Y-27632.
- No dia seguinte, substitua cada poço por 100 μL do meio fresco.
- Nos dias 0 e 1: aspirar o meio de cultura e substituir por 100 μL de meio KSR (3.1.2) suplementado com 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189.
- Nos dias 2 e 3: Aspirar o meio de cultura e substituir por 100 μL de meio KSR suplementado com 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nos dias 4 e 5: Preparar um meio misto composto por 75% de meio KSR e 25% de meio N2 (3.1.3). Em seguida, aspire o meio de cultura e substitua por 100 μL de meio misto suplementado com 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nos dias 6 e 7: Prepare um meio misto composto por 50% de meio KSR e 50% de meio N2. Em seguida, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por 100 μL de meio misto suplementado com 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM de ácido retinóico e 1 μM SAG.
- Nos dias 8 e 9: Prepare um meio misto composto por 25% de meio KSR e 75% de meio N2. Em seguida, aspire o meio de cultura e substitua por 100 μL de meio misto suplementado com 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nos dias 10 e 11: Substitua o meio por 100 μl de meio N2 suplementado com 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- No dia 12: Prossiga para transferir os MNs para o chip de cultura de tecidos (Etapa 6) ou substitua o meio por 100 μL do meio de maturação (3.1.4) suplementado com 20 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
nota: O MNS pode ser transferido para o chip de cultura de tecidos a partir do dia 12 até o dia 19. Os esferoides que não são transferidos devem ser mantidos cultivados em placas inferiores em U de 96 poços em meio de maturação suplementado com 20 ng/ml de BDNF até à transferência.
6. Preparação do chip de cultura de tecidos para formação de organoides do nervo motor (MNO)
- Esterilize o PDMS preparado (da etapa 2.13) imergindo-o em etanol a 70% na placa de Petri por pelo menos 1 h.
nota: Todas as etapas a seguir devem ser manipuladas em um gabinete de biossegurança.
- Esterilize o vidro do microscópio (76 x 52 mm) mergulhando-o em etanol a 70% na placa de Petri.
- Durante o processo de secagem do vidro do microscópio, coloque o dispositivo PDMS no vidro do microscópio meio úmido e deixe-o secar completamente esperando durante a noite. Depois de completamente seco, o dispositivo PDMS deve aderir ao vidro.
nota: Essa colagem não é permanente para permitir o desprendimento dos dispositivos PDMS do vidro do microscópio após a cultura para coleta de tecido. A ligação permanente por plasma de oxigênio pode ser usada para maximizar a adesão entre o PDMS e o vidro, mas proibiria a desmontagem dos chips e a coleta de tecido.
- Cubra a superfície do microcanal com dispositivo PDMS e vidro de microscópio com 30 μL de matriz de membrana basal diluída em DMEM/F12 (1:40) fazendo uma gota em um lado da entrada do canal e, em seguida, aspire a solução do outro lado da entrada com uma pipeta ou bomba de sucção (Figura 3A). Não aspire muito volume de solução para evitar contaminação por bolhas.
- Em seguida, incube o dispositivo PDMS por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C em um recipiente secundário (por exemplo, placa de Petri).
7. Formação de organoide do nervo motor (MNO)
- Substitua a solução de revestimento por 150 μL de meio de maturação pré-aquecido suplementado com 20 ng/mL de BDNF imediatamente antes de usar.
- Em seguida, coloque o MNS da etapa 5.2.9 na entrada do microcanal usando uma micropipeta com uma ponta de diâmetro largo. O MNS pode se estabelecer espontaneamente na parte inferior do dispositivo por gravidade. Não aplique muita pressão ao injetar o MNS (Figura 3B).
nota: Se o MNS estiver preso na parede lateral de um orifício em um chip de cultura de tecidos, aspire suavemente a solução do outro lado da entrada.
- Encha um pequeno reservatório (por exemplo, uma tampa de tubo de 15 mL) com água estéril e coloque-o próximo ao chip de cultura de tecidos no recipiente secundário para evitar a evaporação do meio. Em seguida, coloque-o em uma incubadora de 5% de CO2/37 °C.
- Para uma mudança de meio, aspire o meio de cultura exaurido do centro do reservatório do meio ( Figura 3C ). Não aspire todo o meio e o tecido.
- Adicione delicadamente o meio de maturação fresco (com BDNF). O meio deve ser trocado a cada 2-3 dias. Não seque o meio de cultura em nenhum momento durante a cultura. Os axônios crescem de um MNS para o canal e se montam espontaneamente em um único feixe em 2-3 semanas, o que resulta na formação de um MNO. O MNO pode ser cultivado por mais de 1 mês adicional no dispositivo.
