$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Culturas de células e pré-diferenciação
- Cultura e pré-diferenciação de células-tronco neurais
- Prepare lamínulas revestidas com poli-D-lisina. Coloque uma lamínula estéril (20 mm de diâmetro) em uma placa de 12 poços. Cubra a lamínula com poli-D-lisina, 0,1% p/v, em água para melhor adesão celular nas lamínulas seguindo os próximos passos.
NOTA: As condições ideais devem ser determinadas para cada linhagem celular e aplicação.
- Cubra assepticamente a superfície da lamínula com poli-D-lisina, 0,1% p / v, em água. Balance suavemente para garantir um revestimento uniforme da superfície da lamínula.
- Após a cultura durante a noite (~12 h) a 37°C, remova a solução de poli-D-lisina e enxágue a superfície 3x com 1 mL de água estéril.
- Seque as células pelo menos 30 minutos antes de semeá-las.
- Cultura e pré-diferenciação de células-tronco neurais murinas C17.2 (C17.2-NSC)
- Incubar C17.2-NSCs em um frasco de 25 cm2 em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 5% de soro de cavalo (HS) e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO2 por ~ 2 - 3d.
- Quando as células atingirem 85% de confluência, remova o meio, lave as células com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de tripsina fresca (0,25%) no frasco. Deixe agir por 1 min; em seguida, adicione 1 ml de meio de cultura ao balão e pipete várias vezes para cima e para baixo para garantir uma suspensão unicelular.
- Conte a densidade das células na suspensão usando um hemocitômetro. Calcule o volume necessário de suspensão celular para obter uma concentração celular final de 2 x 104 células / mL.
- Semeie os C17.2-NSCs nas lamínulas revestidas na placa de 12 poços com uma densidade de ~ 2 x 104 células por poço. Verifique a densidade celular ao microscópio.
NOTA: Para um melhor resultado, a densidade celular ideal deve ser determinada antes do experimento de imunofluorescência.
- Incubar as células a 37°C numa incubadora de células durante 12 h para permitir a fixação.
- Após a fixação, lave as células 2x com 1 mL de PBS e cultive as células com um meio de diferenciação composto por DMEM/F12 com suplemento de N2% a 1% por 48 h antes do tratamento com plasma.
- Cultura primária de células-tronco neurais de ratos e pré-diferenciação
- Cultivar a suspensão primária de NSC (células estaminais neurais) de rato em meio de crescimento NSC de rato em frascos T25 não revestidos com uma densidade de 5 x 10,5 células.
- Verifique a formação de neuroesferas sob um microscópio invertido. Certifique-se de que a morfologia das neuroesferas exiba complexos multicelulares esféricos e transparentes.
- Quando as neuroesferas atingirem um diâmetro de 3 mm ou maior, transfira a suspensão da neuroesfera para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e deixe as neuroesferas assentarem por gravidade.
- Remova o sobrenadante com cuidado para deixar as neuroesferas em um volume mínimo de meio.
- Enxágue as neuroesferas 1x com 5 mL de PBS e deixe as neuroesferas assentarem por gravidade. Remova o sobrenadante para deixar um volume mínimo de PBS.
- Adicione um volume adequado de meio de diferenciação para ajustar a densidade celular para ~ 12 - 15 neuroesferas por mililitro. O meio de diferenciação para NSCs primários de ratos consiste em DMEM/F12, 2% de B27 e 1% de FBS.
- Semeie 1 mL de suspensão de neuroesfera em cada lamínula revestida na placa de 12 poços.
NOTA: Agite a placa suavemente para garantir que as neuroesferas sejam distribuídas uniformemente. Esta etapa é fundamental para um melhor resultado de imunofluorescência.
- Colocar a placa na incubadora e deixá-la pré-diferenciar durante 24 h antes do tratamento com plasma.
2. Preparação dos jatos de plasma
- Escolha um tubo de quartzo semiaberto com um diâmetro interno de 2 mm e um diâmetro externo de 4 mm. Insira um fio de alta tensão com um diâmetro de 2 mm no tubo.
- Insira o tubo de quartzo com o alto volumetage fio em uma seringa de 5 mL e use um suporte para montá-lo dentro do centro da seringa. Defina a distância entre a extremidade selada do tubo de quartzo e a ponta da seringa em 1 cm.
- Conecte um tubo de borracha de silicone de 1 m (com diâmetro interno de 12 mm) à extremidade aberta da seringa e, em seguida, conecte-o ao medidor de vazão e à válvula de gás em sequência.
3. Aquisição dos jatos
- Conecte o circuito conforme mostrado na Figura 1. Conecte o fio de saída da fonte de alimentação ao dispositivo de jato de plasma e, em seguida, conecte a ponta da sonda de alta tensão com o fio de saída para detectar a tensão. Conecte a outra extremidade da ponta de prova de alta tensão ao osciloscópio para registrar as informações da tensão de saída. Verifique todo o circuito e certifique-se de que a fonte de alimentação, o osciloscópio e o alto volumetage a sonda estão todos aterrados.
- Verifique a linha de gás. Certifique-se de que o tubo de gás foi conectado ao dispositivo de jato de plasma; em seguida, abra a válvula de gás do hélio (fração de volume, 99,999%) e oxigênio (fração de volume, 99,999%) e ajuste o fluxo de gás para 1 L: 0,01 L/min (He:O2).
NOTA: Deixe o gás fluir por alguns minutos antes de ligar a fonte de alimentação pela primeira vez.
- Defina a amplitude de pulso, frequência e largura de pulso como 8 kV, 8 kHz e 1600 ns, respectivamente. Verifique o circuito novamente e, em seguida, ligue o botão de saída para criar um jato de plasma.
CUIDADO: Não toque no alto volumetage fio em nenhum momento.
4. Tratamento plasmático de células-tronco neurais
- Defina a distância entre o bico da seringa e o orifício do poço da célula para 15 mm.
NOTA: A distância é medida a partir da parte inferior da plataforma onde a placa de 12 poços é colocada.
- Retire a placa de 12 poços da incubadora e mude o meio das células pré-diferenciadas para 800 μL de meio de diferenciação fresco.
- Divida as células em três grupos: um grupo de controle não tratado, um grupo de tratamento de fluxo de gás He-and-O2 (1%) de 60 s e um grupo de tratamento de plasma de 60 s.
NOTA: Não há perda óbvia de líquido sob a condição de tratamento.
- Coloque a placa de 12 poços sob os jatos de plasma, certifique-se de que o bico da seringa esteja fixado no centro de cada orifício e dê o tratamento relevante aos diferentes grupos mencionados na etapa 4.3.
NOTA: Os controles não tratados foram mantidos em meio de diferenciação à temperatura ambiente durante o procedimento experimental para garantir condições de tratamento uniformes. O grupo de tratamento com fluxo de gás He-and-O2 (1%) foi tratado apenas com um fluxo de gás He e O2 (1%), sem geração de plasma. Todos os tratamentos devem ser realizados em triplicata.
5. Diferenciação de células-tronco neurais
- Após o tratamento, remova a cultura original e adicione 1 mL de novo meio de diferenciação a cada poço.
- Incubar as células na incubadora a 37°C e 5% de CO2 durante 6 dias. Mudar o meio em dias alternados.
- Verifique o status de diferenciação dos diferentes grupos diariamente sob um microscópio óptico de contraste de fase invertido Figura 2. Selecione aleatoriamente pelo menos 12 campos e tire fotos para registrar as mudanças morfológicas.
