Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Resumo

Fonte: Tischfield, D. J., et al Diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em precursores de interneurônios corticais. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo apresenta um método para gerar precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. O protocolo envolve a cultura das células-tronco em meios contendo inibidores específicos de pequenas moléculas, que facilitam a proliferação e agregação de células-tronco em corpos embrióides (EBs). Posteriormente, os EBs são dissociados com enzimas e plaqueados em poços de placa de cultura revestidos com proteínas de adesão para promover sua diferenciação em precursores de interneurônios corticais.

Protocolo

1. Preparação de mídia

NOTA: Aqueça todas as mídias para 37 ° C antes da utilização em cultura de células.

1. Meio de fibroblasto embrionário de camundongo (MEF) (para preparar 500 mL)
   1. Adicione 50 mL de soro fetal bovino (FBS) a 449 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e filtre através de uma unidade de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Adicionar 1 ml de agente antimicrobiano (50 mg/ml) após a filtração. Armazene a mídia a 4 °C por até 1 mês ou alíquota e armazene a ≤ -20 °C.
2. Meio N2 (para preparar 500 mL)
   1. Adicione 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100x) e 500 μL de 2-mercaptoetanol (55 mM) a 489,5 mL de DMEM: Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F-12) e filtre através de uma unidade de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Adicione 1 mL de agente antimicrobiano (50 mg / mL) e 5 mL de suplemento de N2-B após a filtração. Armazene a mídia a 4 °C no escuro por até 1 mês.
3. Meio de crescimento sem soro (KSR) (para preparar 500 mL)
   1. Adicione 75 mL de suplemento de meio sem soro, 5 mL de L-glutamina (100x), 5 mL de aminoácidos não essenciais MEM (MEM-NEAA) (100x) e 500 μL de 2-mercaptoetanol (55 mM) a 413,5 mL de DMEM sem glutamina e filtre através de uma unidade de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Adicionar 1 ml de agente antimicrobiano (50 mg/ml) após a filtração. Armazene a mídia a 4 °C por até 1 mês.
4. Meio de células-tronco embrionárias de camundongo (para preparar 500 mL)
   1. Adicione 75 mL de FBS de grau de células-tronco, 5 mL DE MEM-NEAA (100x), 5 mL de L-glutamina (100x) e 500 μL de 2-mercaptoetanol (55 mM) a 413,5 mL de DMEM sem glutamina e filtre através de uma unidade de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Adicionar 1 ml de agente antimicrobiano (50 mg/ml) após a filtração. Armazene a mídia a 4 °C no escuro por até 1 mês ou alíquota e armazene a ≤ -20 °C.

2. Cultura de mESCs

1. Plaquear células alimentadoras de MEF mitoticamente inativas em meio MEF em placas tratadas com cultura de tecidos a 3-4 x 10⁴ células/cm². Aguarde pelo menos 12 horas para que eles se depositem em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% de CO₂ antes de plaquear os mESCs. Se não for usado imediatamente, substitua a mídia MEF a cada 3 dias. Descarte os MEFs se não forem usados dentro de 7 dias após o revestimento.
2. Adicione mESCs (faixa de densidade de 1-4 x 10⁴ células/^cm2) às placas de MEF em meio mESC contendo Fator Inibidor de Leucemia de Camundongo (mLIF) (1.000 U/mL). Incubar as células a 37 °C com ≥ 95% de humidade relativa e 5% de CO₂.
3. Passe mESCs usando tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) (1:5-1:10) assim que o prato se tornar ~ 70-80% confluente ou se as colônias começarem a se tocar. Isso normalmente ocorre a cada 2 dias, mas pode levar até 4 ou 5 dias, dependendo da densidade inicial do revestimento.
4. Mantenha os mESCs em uma camada alimentadora de MEF em um meio mESC para manter a pluripotência.
5. Antes de iniciar a diferenciação, passe as células pelo menos uma vez em placas revestidas de gelatina sem MEFs para diluir os MEFs.​
   1. Prepare placas revestidas com gelatina adicionando gelatina a 0,1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Ca²⁺/Mg²⁺ a uma placa tratada com cultura de tecidos e deixando a 37 °C por pelo menos 1 h. Placa 1,5-2 x 10 6 células/placa de 10 cm (2,7-3,6 x 10⁴ células/cm²) e deixe as células se expandirem por 2 dias antes de iniciar a diferenciação.

3. Diferenciando mESCs em progenitores telencéfalos semelhantes a MGE

1. Dia de diferenciação (DD) 0 = "células flutuantes"
   1. Depois que as mESCs crescerem em placas revestidas de gelatina por 2 dias, aspire o meio e lave as células uma vez com PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺. Adicione tripsina-EDTA suficiente (0,05% de tripsina) para cobrir a superfície da placa (normalmente 4 mL de tripsina-EDTA para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm) e coloque as células de volta na incubadora a 37 ° C com ≥95% de umidade relativa e 5% de CO₂ por 4 min.
   2. Após 4 min, extinguir a tripsina-EDTA usando 2 vezes o volume com meio mESC. Transfira as células para um tubo de centrífuga de tamanho apropriado e centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Após 5 min, remova o tubo e aspire o meio sem perturbar o pellet. Ressuspenda o pellet em meio KSR:N2 de 1 mL (1:1) contendo o inibidor de BMP LDN-193189 (250 nM) e o inibidor de Wnt XAV-939 (10 μM).
   3. Meça a concentração celular usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado. Comece a cultivar células como corpos embrióides (EBs) adicionando 75.000 células/mL em meio KSR:N2 (1:1) contendo LDN-193189 (250 nM) e XAV-939 (10 μM) em placas de cultura de tecidos não aderentes. Incubar as células a 37 °C com ≥ 95% de humidade relativa e 5% de CO₂.
2. Em DD1, prepare-se para o "pouso" celular revestindo placas tratadas com cultura de tecidos com poli-L-lisina (10 μg / mL em PBS com Ca^{2 +} / Mg²⁺) durante a noite (O / N) a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa ou por pelo menos 1 h.
3. Em DD2, aspirar a poli-L-lisina e revestir as placas com laminina (10 μg/mL em PBS com Ca²⁺/Mg²⁺) O/N a 37 °C com ≥ 95% de umidade relativa.
   nota: Embora O/N seja ideal, apenas 2 h podem ser suficientes. Se as placas não forem usadas até o dia seguinte, aspire a laminina, substitua por PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺ e armazene a 4 °C por até 2 semanas.
4. DD3 ("células terrestres")
   1. Antes de iniciar a dissociação da EB, aspire a laminina e deixe as placas secarem completamente em uma capa de cultura de tecidos. Não use placas que pareçam brilhantes ou visivelmente molhadas. Transfira os EBs com meio para um tubo de 15 mL e centrifugue por 3-4 min a 15 x g ou até que os EBs tenham peletizado.
5. Aspire o meio e adicione 3 mL de solução de descolamento celular contendo DNase (2 U / mL) e incube a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% de CO₂ por 15 min. Agite suavemente o tubo a cada 3 min para ajudar na dissociação do EB.
6. Quando os EBs não estiverem mais visíveis ou tiverem decorrido 15 min, adicione 6 mL KSR:N2 (1:1) contendo DNase (1 U/mL) e centrifugue por 5 min a 200 x g.
7. Coloque as células em KSR: N2 (1: 1) contendo LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) e o inibidor ROCK Y-27632 (10 μM) a 4,5-5 x 10⁴ células / cm².

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fibroblastos embrionários de camundongos (CF-1 MEF IRR 7M)	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 frasco de MEFs 7M é suficiente para quatro placas de TC de 10 cm.
FBS	Biológicos de Atlanta	S11150H
Primocin	Invivogen	Formiga-pm-2	Também conhecido como agente antimicrobiano. Não filtre com mídia base -- adicione após a filtragem.
Suplemento de N2-B	Tecnologias de células-tronco	Nº 7156	Não filtre com mídia base - adicione após a filtração
Glutamax (100x)	ThermoFisher	35050061	Também conhecida como L-alanina-L-glutamina.
Reposição de soro KnockOut (KSR)	ThermoFisher	10828028	Também conhecido como suplemento médio sem soro.
L-glutamina (100x)	ThermoFisher	25030081
MEM-NEAA (100x)	ThermoFisher	11140050
2-Mercaptoetanol	ThermoFisher	21985023
KnockOut DMEM	ThermoFisher	10829018
Hyclone FBS	VWR	82013-578	Também conhecido como FBS de grau de células-tronco.
Prato tratado com cultura de tecidos (10cm)	Falcão BD	353003
Placa de Petri estéril não aderente (10cm)	VWR	Rolamento 25384-342
Fator inibidor da leucemia (mLIF)	Química	ESG1107	Não congele, armazene a 4'C.
DMEM/F12	ThermoFisher	11330032
Solução de gelatina a 0,1%	ATCC	ATCC PCS-999-027
Laminina	sigma	L2020
Poli-L-lisina	sigma	Pág. 6282
Tripsina-EDTA (0,05%)	ThermoFisher	25300054
Accutase	ThermoFisher	A1110501	Também conhecido como reagente de dissociação celular sem tripsina.
DNase livre de RNase RQ1	Promega	M610A
LDN-193189	Stemgent	04-1974	Ressuspenda em DMSO e armazene a -80'C em alíquotas de uso único
XAV939	Stemgent	04-1946	Ressuspenda em DMSO e armazene a -80'C em alíquotas de uso único
Inibidor de ROCK (Y-27632)	Tocris	1254	Ressuspenda em DMSO e armazene a -80'C em alíquotas de uso único