Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

Resumo

Fonte: Hanafiah, A., et al. Diferenciação e Caracterização de Progenitores Neurais e Neurônios de Células-Tronco Embrionárias de Camundongo. J. Vis. Exp. (2020).

O vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em corpos embrióides (EBs) pelo método de gota suspensa. Ao suspender as mESCs em gotas suspensas e incubadas, as células se agregam para formar EBs, que são posteriormente diferenciadas em células progenitoras neuronais (NPCs) usando um meio de diferenciação suplementado com ácido retinóico (RA).

Protocolo

1. Cultura mESC

1. Cubra uma placa tratada com cultura de tecidos de 10 cm com gelatina a 0,1% e deixe a gelatina endurecer por pelo menos 15 a 30 minutos antes de aspirá-la.
2. Semeie fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) irradiados com γ um dia antes da cultura dos mESCs no meio mESC pré-aquecido (meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, fator inibidor de leucemia (LIF), PD0325901 (PD) e CHIR99021 (CH)).
3. Permita que os MEFs irradiados com γ assentem e se fixem à superfície da placa antes de cultivar células E14.
4. Descongelar as ESCs E14 em banho-maria a 37 °C e transferir rapidamente as células para um tubo cónico de 15 cm com meio mESC quente. Pulverize as células a 200 x g por 3 min e remova o sobrenadante.
5. Ressuspenda as células em 10 mL de meio mESC e coloque as células na placa de cultura contendo os MEFs irradiados com γ semeados anteriormente. Incubar a cultura celular numa incubadora a 37 °C a 5% de CO₂.
6. Para a passagem da cultura, aspire o meio e lave a placa com solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) estéril. Adicione tripsina a 0,05% suficiente para cobrir a superfície da placa e incube a 37 °C por 3 min.
7. Neutralize a tripsina com meio mESC e pipeta para gerar suspensão unicelular. Centrifugue as células a 200 x g durante 3 min e retire o sobrenadante.
8. Conte as células com um hemocitômetro ou contador de células e semeie cerca de 5,0 x 10⁵ células em uma placa de cultura de 10 cm.
9. Ressuspenda as células em 10 mL de meio mESC, coloque as células na placa de cultura de tecidos revestida com gelatina e incube as culturas conforme descrito anteriormente.
   nota: Recomenda-se que as mESCs sejam passadas a cada 2 dias para evitar que as células se diferenciem em suas colônias. O vermelho de fenol no meio funciona apenas como um indicador de pH e, dependendo da densidade celular, pode ficar amarelado (mais ácido), antes de 2 dias. Portanto, pode ser necessário mudar o meio todos os dias. Os MEFs irradiados com γ acabarão morrendo após algumas passagens.

2. EB, NPC e diferenciação de neurônios

1. Execute o protocolo de passagem de cultura e conte as células.
2. Método de queda suspensa (dia 0)
   1. Para uma placa de cultura de células de 10 cm, conte aproximadamente 2,5 x 10⁴ células onde 5,0 x 10² células serão suspensas em meio de diferenciação de 20 μL (DMEM com 15% de FBS, aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e piruvato de sódio). Aproximadamente cinquenta gotículas de 20 μL contendo as células podem ser semeadas em uma placa de 10 cm.
   2. Alíquota do número adequado de células e, em seguida, centrifugue as células a 200 x g durante 3 min e retire o sobrenadante.
   3. Ressuspenda as células no volume apropriado de meio de diferenciação para uma densidade celular de 5,0 x 10² células por 20 μL (por exemplo, 2,5 x 10⁴ células em 1 mL de meio de diferenciação).
   4. Usando uma micropipeta ou uma pipeta repetidora, coloque gotículas de 20 μL da suspensão celular na tampa da placa de cultura de tecidos. Certifique-se de que as gotículas não estejam muito próximas umas das outras para evitar que se fundam.
      nota: As gotículas podem ser plaqueadas em uma placa de fixação tratada com cultura de tecidos ou placa de suspensão, pois serão colocadas na tampa e não na própria placa. Para uma abordagem mais viável e estéril, coloque as gotículas em uma placa de cultura de tecidos de fixação e transfira-as para uma placa de suspensão, conforme descrito abaixo.
   5. Encha o prato com 5–10 mL de 1x PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta no prato. Incubar a cultura na incubadora a 37 °C.
      nota: O PBS é adicionado à placa de cultura para evitar que as gotículas sequem.
3. No dia 2, use uma micropipeta para coletar as gotículas da tampa e coloque-as em uma placa de suspensão de cultura de células de 10 cm preenchida com 10 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em um agitador orbital agitando em baixa velocidade na incubadora.
4. No dia 4, para colher os EBs, coletar as células, centrifugar a 200 x g por 3 min e remover o sobrenadante.
   nota: Os EBs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com os requisitos de experimentos subsequentes.
5. Para continuar o procedimento e induzir a diferenciação EB em células progenitoras neurais (NPCs), prepare o meio de diferenciação com ácido retinóico (RA) 5 μM.
6. Remova o meio antigo peletizando os EBs a 100 x g por 3 min ou deixe os EBs assentarem antes de aspirar o meio antigo. Adicionar 10 ml do meio de diferenciação contendo 5 μM de AR à placa de cultura.
7. No dia 6, substitua pelo menos metade do meio por meio novo contendo 5 μM de AR, inclinando a placa e pipetando o meio conforme descrito acima.
   nota: Recomenda-se que pelo menos metade do meio seja substituído por meio novo contendo AR nos dias 5 e 7. Tome nota do indicador de vermelho de fenol; Se ficar amarelado, é melhor substituir todo o meio.
8. No dia 8, colha os NPCs coletando as células, centrifugando a 200 x g por 3 min e removendo o sobrenadante.
   nota: Os NPCs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com as necessidades dos experimentos subsequentes. Se necessário, os NPCs podem ser congelados e descongelados novamente para posterior cultura e análise. Se os NPCs forem cultivados, a accutase também pode ser usada como alternativa à tripsina.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% de tripsina + 0,53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0,1% de gelatina	sigma	G1890-100G	Preparado em água desionizada
CHIR99021	Produtos químicos Cayman	Rolamento 13122
DMEM	Corning	10-017-CM
Meio DMEM/F12	Thermo Fisher Científico	11320033
Amortecedor EB	Qiagen	Rolamento 19086
etanol	111000200	Pharmco	Diluído em água desionizada
Soro fetal bovino	Biológicos de Atlanta	S10250
L-glutamina	Thermo Fisher Científico	25030024
Lif	N/A	N/A	Coletado do sobrenadante MEF
MEM Aminoácidos não essenciais	Corning	25-025-CL
PD0325901	Produtos químicos Cayman	Rolamento 13034
Penicilina/estreptomicina	Corning	30-002-CL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	N/A	N/A	Preparado em água desionizada
Cloreto de potássio	Pág. 217-500G	VWR
Fosfato de potássio monobásico anidro	0781-500G	VWR
cloreto de sódio	BP358-10	Biorreagentes Fisher
Fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado	SX0715-1	Milipore
Ácido retinóico	sigma	R2625	Preparado em DMSO
Piruvato de sódio	Corning	25-000-Cl
β-mercaptoetanol	BioReagentes Fisher	BP176-100