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1. Indução de células-tronco neurais
NOTA: Dependendo das condições da célula, cerca de 5 ou 7 dias após a transfecção, as células aderentes à monocamada atingirão 30 - 50% de confluência (Figura 1C).
- Remova os sobrenadantes contendo células flutuantes e esferas e, em seguida, adicione 1 ml de meio progenitor neural (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), contendo 1x suplemento de N2, 0,1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA), 1% (v/v) de antibióticos, 20 ng/ml de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e 20 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF)) nas células aderentes.
- Opcionalmente, dissocie as esferas celulares pipetando e centrifugando suavemente as células a 170 x g por 10 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 ml de meio progenitor neural em uma nova placa de 24 poços revestida com matrigel de acordo com as instruções como backup.
- Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 60 - 80% confluentes, geralmente após 1 semana.
- Rejeitar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de células estaminais neurais (meio sem soro, NSC SFM). Dissocie as células usando um raspador de células, seguido de uma pipetagem muito suave.
- Remova as células e semeie todas elas em um poço de uma placa de 6 poços. Adicione mais 1 ml de meio de células-tronco neurais para fazer 2 ml de meio para cada poço. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%.
- Mude o meio a cada dois dias.
- Quando as células atingirem 60% de confluência, dissocie e replaquete as células na proporção de 1:3 seguindo as etapas em 1.4 e 1.6.
