Silenciamento de genes mediado por siRNA em células-tronco neurais

Resumo

Fonte: Nguyen, B. H., et al. Cultura e Manipulação de Células da Crista Neural O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Este vídeo demonstra o uso de pequenos RNAs interferentes (siRNA) para silenciar genes específicos de interesse em células-tronco neurais e diferenciá-los em tipos de células desejados usando o meio de diferenciação apropriado. Este procedimento permite o estudo do papel crítico de genes específicos no processo de diferenciação de células-tronco neurais.

Protocolo

1. Manipulação de células O9-1

1. Realizando knockdown de siRNA em células O9-1
   1. Descongele e cubra uma placa de 24 poços com uma matriz de membrana basal antes de iniciar o experimento. Recupere e semeie células O9-1, permitindo que cresçam até 60% a 80% de confluência.
   2. Diluir os lipossomas em meios isentos de soro de acordo com o volume adequado do poço. Diluir o siRNA em meio sem soro até o final. Adicionar siRNA diluído aos lipossomas diluídos numa proporção recomendada pelo fabricante. Misture bem pipetando e depois incube.
      nota: Siga o guia do fabricante sobre o volume usado, tempo e temperatura de incubação.
   3. Adicione um volume apropriado de complexo siRNA-lipídio às células de acordo com as recomendações do fabricante.
   4. Incubar as células durante 24 h numa incubadora de cultura de células padrão (37 °C, 5% de CO₂). Execute as etapas a jusante conforme apropriado (extrair RNA, extrair proteínas, coloração, etc.)
      NOTA: os tempos e concentrações de knockdown de siRNA podem variar dependendo do experimento individual.

2. Diferenciação de células O9-1

1. Diferenciação de células O9-1 em osteoblastos
   1. Para preparar meios de diferenciação osteogênica, diluir o seguinte em alfa-MEM (as concentrações finais são indicadas): 0,1 μM de dexametasona, 100 ng/mL de proteína morfogenética óssea 2 (BMP2), 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de b-glicerofosfato, 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Detectar o marcador osteoblástico, osteocalcina, em osteoblastos diferenciados por imunocoloração, conforme mostrado na Figura 1.
      NOTA: A diferenciação osteogênica também pode ser avaliada usando outros marcadores de osteoblastos ou com coloração com vermelho de alizarina ou fosfatase alcalina.
2. Diferenciação de células O9-1 em células musculares lisas
   1. Para preparar meios de diferenciação de células musculares lisas, dilua o seguinte em DMEM (as concentrações finais são indicadas): penicilina 100 U / mL, estreptomicina 100 μg / mL e 10% de FBS.
   2. Avalia a diferenciação de células musculares lisas com coloração por imunofluorescência usando anticorpos contra marcadores de células musculares lisas, como a actina de músculo liso (SMA), mostrada como exemplo na Figura 2.

Resultados

Figura 1: Coloração por imunofluorescência do marcador osteoblasto osteocalcina (Ocn) indicando que as células O9-1 deram origem a células osteoblásticas sob condições de diferenciação osteogênica. As células foram coradas com o anticorpo Ocn marcador de osteoblastos (verde) e os núcleos foram corados com DAPI (azul). As setas indicam células Ocn-positivas. Osteocalcina (Ocn, um marc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular de crista neural craniana de camundongo O9-1	Millipore Sigma	SCC049
DMEM, glicose alta, sem glutamina	Gibco	11960-044
DMEM, glicose alta	Hyclone	SH30243.01
FBS (soro fetal bovino)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicilina - estreptomicina	Gibco	15140-122
L-glutamina 200mM (100X)	Gibco	Rolamento 25030-081
Tripsina-EDTA 0,25% em HBSS	Genesee Científico	25-510
DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) sem cálcio ou magnésio	Lonza	17-512F
Aminoácidos não essenciais MEM (MEM NEAA) 100X	Gibco	Rolamento 11140-050
Piruvato de sódio (100mM)	Gibco	Rolamento 11360-070
2-Mercaptoetanol	sigma	M-7522
Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes-básico (rhFGF-básico)	Sistemas de P&D	233-FB-025
Mitomicina C	Roche	10107409001
Matriz de matrigel	Corning	356234
DMSO (dimetilsulfóxido)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamina RNAiMAX	Thermo Fisher Científico	13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	Rolamento 31985-070
Meio essencial mínimo, alfa 1X com sais de Earle, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos, & L-glutamina	Corning	10-022-CV
NO ALVOmais Wwtr1 siRNA	Dharmacon	L-041057
Pool sem direcionamento ON-TARGETplus	Dharmacon	D-001810
NO ALVOmais Yap1 siRNA	Dharmacon	L-046247
FCS (soro fetal de bezerro)
ITS (insulina-transferrina-selênio)
TGF-b3
ácido ascórbico
BMP2 (proteína morfogenética óssea 2)
dexametasona
Suplemento B-27