Silenciamento de genes mediado por siRNA em células-tronco neurais

1. Manipulação de células O9-1

1. Realizando knockdown de siRNA em células O9-1
   1. Descongele e cubra uma placa de 24 poços com uma matriz de membrana basal antes de iniciar o experimento. Recupere e semeie células O9-1, permitindo que cresçam até 60% a 80% de confluência.
   2. Diluir os lipossomas em meios isentos de soro de acordo com o volume adequado do poço. Diluir o siRNA em meio sem soro até o final. Adicionar siRNA diluído aos lipossomas diluídos numa proporção recomendada pelo fabricante. Misture bem pipetando e depois incube.
      nota: Siga o guia do fabricante sobre o volume usado, tempo e temperatura de incubação.
   3. Adicione um volume apropriado de complexo siRNA-lipídio às células de acordo com as recomendações do fabricante.
   4. Incubar as células durante 24 h numa incubadora de cultura de células padrão (37 °C, 5% de CO₂). Execute as etapas a jusante conforme apropriado (extrair RNA, extrair proteínas, coloração, etc.)
      NOTA: os tempos e concentrações de knockdown de siRNA podem variar dependendo do experimento individual.

2. Diferenciação de células O9-1

1. Diferenciação de células O9-1 em osteoblastos
   1. Para preparar meios de diferenciação osteogênica, diluir o seguinte em alfa-MEM (as concentrações finais são indicadas): 0,1 μM de dexametasona, 100 ng/mL de proteína morfogenética óssea 2 (BMP2), 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de b-glicerofosfato, 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Detectar o marcador osteoblástico, osteocalcina, em osteoblastos diferenciados por imunocoloração, conforme mostrado na Figura 1.
      NOTA: A diferenciação osteogênica também pode ser avaliada usando outros marcadores de osteoblastos ou com coloração com vermelho de alizarina ou fosfatase alcalina.
2. Diferenciação de células O9-1 em células musculares lisas
   1. Para preparar meios de diferenciação de células musculares lisas, dilua o seguinte em DMEM (as concentrações finais são indicadas): penicilina 100 U / mL, estreptomicina 100 μg / mL e 10% de FBS.
   2. Avalia a diferenciação de células musculares lisas com coloração por imunofluorescência usando anticorpos contra marcadores de células musculares lisas, como a actina de músculo liso (SMA), mostrada como exemplo na Figura 2.

Figura 1: Coloração por imunofluorescência do marcador osteoblasto osteocalcina (Ocn) indicando que as células O9-1 deram origem a células osteoblásticas sob condições de diferenciação osteogênica. As células foram coradas com o anticorpo Ocn marcador de osteoblastos (verde) e os núcleos foram corados com DAPI (azul). As setas indicam células Ocn-positivas. Osteocalcina (Ocn, um marcador de osteoblastos); DAPI (′,6-diamidino-2-fenilindo)

Figura 2: A coloração por imunofluorescência da actina de músculo liso (SMA) indicou que, sob condições de diferenciação de células musculares lisas, a maioria das células O9-1 do tipo selvagem deu origem a células musculares lisas (A), enquanto as células Yap-null O9-1 não conseguiram se diferenciar em células musculares lisas (B). As células foram coradas com o anticorpo SMA (vermelho) e os núcleos foram corados com DAPI (azul). As setas indicam células positivas para SMA.