Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento de Colônias de Células Progenitoras Neurais Induzidas por Putação (iNPC)
- Um dia antes de colher colônias de iNPC, cubra uma placa de 48 poços com laminina: dilua a laminina a 1 μg / ml em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), adicione 300 μl da solução em placas e mantenha a 4 ° C por 24 horas. Um dia depois, aspire a laminina das placas e adicione 200 μl de meio de neuroindução (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml de fator inibidor da leucemia humana, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) aos poços.
- Lave as placas de 6 poços contendo as colônias a serem colhidas uma vez com DPBS e adicione 2 ml de meio de neuroindução por alvéolo de placa de 6 poços. Escolha as colônias mecanicamente: raspe as colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundantes; Defina o pipetman de 200 μL em 50 μl e pegue as colônias usando as respectivas pontas de pipeta.
- Transfira uma colônia para cada um poço de uma placa de 48 poços revestida com laminina e gere mecanicamente uma única suspensão celular pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione o inibidor de ROCK Y27632 em uma concentração final de 10 μM às células.
- Cultive as células na placa de 48 poços a 37 ° C, 5% de CO2 por 2 dias. Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80 - 90% de confluência (aprox. 3 - 4 dias).
