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1. Preparação de placas de 24 poços para culturas de neurônios de alta densidade
NOTA: Execute as seguintes etapas (2-3) no dia anterior à colheita planejada de embriões.
- Traga duas placas de 24 poços para a capa de cultura de células e abra a embalagem individual.
- Ligue uma agulha de seringa de 18 G a uma seringa de plástico descartável de 1 ml.
- Segure a seringa e aponte a ponta da agulha para ~1 mm à esquerda para o centro do fundo do poço. Aplique força moderada (~ 250 g) para gravar o fundo do poço (~ 1 mm de comprimento). Uma ranhura será formada e os materiais plásticos deslocados formarão um suporte elevado acima da superfície do poço de fundo plano. Grave outra ranhura paralela de ~ 1 mm de comprimento a ~ 1 mm à direita do centro do fundo de maneira semelhante.
- Repita esta etapa para todos os poços das duas placas de 24 poços. As duas placas de 24 poços usadas para cultura de alta densidade estão agora prontas para revestimento com poli-D-lisina (consulte a etapa 2.8 abaixo).
2. Preparação de lamínulas para culturas de neurônios de baixa densidade
- Use vidro redondo # 1 de 12 mm de diâmetro.
- Colocar 50 lamínulas dentro de uma placa de Petri de plástico estéril de 100 mm de diâmetro e mergulhar as lamínulas em 20 ml de solução de etanol a 70%. Coloque esta placa de Petri em uma plataforma giratória com rotação de velocidade moderada (70 rpm) por uma hora. Remova o etanol 70% e substitua por um novo lote de etanol 70%. Gire e lave por mais uma hora.
- Descarte a solução de limpeza com etanol a 70%. Adicione água estéril (filtrada através de uma unidade de filtro de 0,2 μm). Enxágue as lamínulas rigorosamente girando a placa de Petri com a mão. Enxágue três vezes, cada vez substituindo por água fresca e estéril.
- Colocar a placa de Petri com lamínulas dentro de uma capa de cultura de células esterilizada com fluxo laminar. Aspire a água de enxágue através da linha de vácuo e adicione 10 ml de água estéril filtrada para imergir as lamínulas. As lamínulas devem ser estéreis e a superfície deve estar limpa o suficiente para o revestimento de poli-D-lisina.
- Abra duas placas de 24 poços de sua embalagem individual e coloque-as no capô.
- Ligue a linha de vácuo no exaustor. Conecte uma ponteira de pipeta de 200 μl à linha de vácuo e use uma tesoura para cortar a ponteira para criar uma abertura maior.
- Use uma pinça de ponta fina #5 para pegar lamínulas da placa de Petri, uma de cada vez, e use a linha de vácuo para secar completamente a lamínula. Em seguida, coloque uma lamínula em cada um dos poços da placa de 24 poços. As 50 lamínulas limpas devem ser suficientes para encher cada um dos poços das duas placas de 24 poços.
- Diluir a solução-mãe de poli-D-lisina (1 mg/ml) numa solução de trabalho (0,1 mg/ml) com um tampão borato (pH 8,5). Para as quatro placas de 24 poços (incluindo duas placas de alta densidade com fundo condicionado), prepare 30 ml de solução de trabalho total.
- Adicionar 300 μl de solução de poli-D-lisina a 0,1 mg/ml a cada alvéolo com lamínulas de vidro. Certifique-se de que as lamínulas estejam completamente imersas na solução. Caso contrário, use a ponta da pinça # 5 para pressionar as lamínulas contra o fundo do poço e use a ponta para guiar a solução de poli-D-lisina para cobrir toda a superfície das lamínulas. Inspecione visualmente todas as lamínulas para garantir que nenhum ar fique preso entre a placa e as lamínulas.
- Adicionar 300 μl de solução de poli-D-lisina a 0,1 mg/ml a cada alvéolo da placa de cultura de alta densidade com fundo condicionado. Gire manualmente para espalhar a solução para cobrir todo o fundo do poço.
- Retorne todas as quatro placas com poli-D-lisina para a incubadora de cultura e incube O/N.
3. Placas de lavagem e pré-condicionamento para cultura
NOTA: As etapas a seguir (3-5) são realizadas no dia da colheita do tecido.
- Após a incubação / revestimento de lamínulas e placas de 24 poços O / N, traga todas as quatro placas (duas com lamínulas doadoras, duas placas aceitadoras de alta densidade com fundo de plástico gravado) para a capela de cultura. Use a linha de vácuo para remover a solução de poli-D-lisina.
- Imediatamente após a remoção da solução de poli-D-lisina, adicione ~ 1 ml de água estéril a cada poço usando uma pipeta de transferência de plástico. Depois que todos os poços estiverem cheios de água, deixe descansar por 10 min. Remova a água por vácuo e, em seguida, adicione 300 μl de meio de lavagem em cada poço para cobrir o fundo do poço (com ou sem lamínulas de vidro). Não deixe o revestimento de poli-D-lisina secar.
- Retorne todas as quatro placas para a incubadora de células. As placas estão prontas para uso assim que os neurônios dispersos do hipocampo estiverem preparados.
4. Revestimento de neurônios e co-cultura de longo prazo
- Traga as duas placas de 24 poços com fundo gravado para neurônios de alta densidade para a capa de cultura de células. Remova o meio pré-condicionado de 300 μl por vácuo. Placa 0,6 ml de suspensões de células de alta densidade a 250.000 neurônios/ml.
- Traga as outras duas placas de 24 poços com lamínulas para a capela de cultura e remova o meio de pré-condição de 300 μl por vácuo. Placa de 0,6 ml de suspensões de células de baixa densidade a 10.000 neurônios/ml nas lamínulas dentro das duas placas de 24 poços.
- Retorne todas as quatro placas de 24 poços para a incubadora. Deixe descansar por 2 horas.
- Vire as lamínulas de baixa densidade com neurônios aderentes à cultura de alta densidade. Certifique-se de que os neurônios estejam voltados um para o outro (ou seja, não separados pela lamínula de vidro). Em seguida, devolva as duas placas com co-cultura à incubadora.
5. Sustentação da co-cultura
- Alimentar as coculturas adicionando 300 μl de meio alimentar fresco (ver Materiais) por dia in vitro (DIV) 5. Não há necessidade de remover 50% do meio de cultura completo original, como relatado por muitos outros estudos. O meio de alimentação também contém 15 μM de citosina arabinosídeo (Ara-C, para produzir uma concentração final de 5 μM) para minimizar a chance de contaminação e proliferação da glia.
- Após esta alimentação inicial, adicione 300 μl de meio de alimentação fresco sem Ara-C ao poço todas as semanas. Se a cultura for mantida por mais de um mês, substitua metade do meio por meio Feed fresco todas as semanas além de um mês (com a primeira meia substituição do meio em DIV33). Morfologicamente, os neurônios de alta e baixa densidade parecem saudáveis por até três meses (o tempo mais longo observado pelos experimentadores).