Diferenciando células progenitoras neurais induzidas em astrócitos

Resumo

Fonte: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. Derivação de Fibroblastos Humanos Adultos e sua Conversão Direta em Células Progenitoras Neurais Expansíveis. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação de células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) em neurônios e astrócitos usando meios especializados.

Protocolo

1. Diferenciação de iNPCs

1. Diferenciação em direção à linhagem neuronal
   1. Células de cultura em placas revestidas de laminina, conforme descrito acima. Mude o meio para neuro-diff-media (DMEM/F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng/ml cAMP, 200 μM de vitamina C, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF) quando as células estiverem aproximadamente 70% confluentes. Mude de mídia a cada dois dias durante três semanas. Não divida as células durante a diferenciação.
   2. Após três semanas, as células devem expressar o marcador neuronal TUJ1. Para obter neurônios e subtipos neuronais mais maduros, continue a diferenciação por até 3 meses.
2. Diferenciação para a linhagem glial
   1. Mude o meio para o meio de indução glial (1:1 DMEM/F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 μM β-mercaptoetanol, 100 μM de aminoácidos não essenciais, 1,5 mM de L-glutamina, 5 μg/ml de insulina, 40 ng/ml T3) incluindo 20 ng/ml de EGF para induzir a diferenciação em células precursoras gliais. Remova metade da mídia e substitua por mídia nova a cada dois dias por cerca de 2 semanas. Durante este período, as células devem ser divididas 1:3 na presença de 10 μM de inibidor de ROCK Y27632 quando 100% de confluência for atingida.
   2. Após 2 semanas, diferencie ainda mais as células em astrócitos: quando as células estiverem quase confluentes, mude o meio para o meio de astrócitos disponível comercialmente, mude o meio a cada dois dias. Após cerca de 7 dias, as células começam a expressar marcadores de astrócitos (por exemplo, GFAP). Se as células ficarem 100% confluentes durante o protocolo de diferenciação, divida-as em uma proporção de 1:2 na presença de 10 μM de inibidor de ROCK Y27632.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios de astrócitos	ScienCell	1801
B27	Tecnologias de Vida	Rolamento 17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
acampamento	sigma	Rolamento A6885
DMEM	Tecnologias de Vida	Rolamento 41966-029
DMEM F12	Tecnologias de Vida	11320-033
Dmso	Roth	4720
DPBS	Tecnologias de Vida	14190-094
FEG	Tecnologias da Vida	PHG0313
Fcs	Biochrom AG	Rolamento 50115
GDNF	Peprotech	450-10
insulina	Seralab	GEM-700-112-P
L-Glutamina	Tecnologias de Vida	Rolamento 25030-024
Laminina	sigma	L2020
N2	Tecnologias de Vida	17502-048
Neurobasal	Tecnologias de Vida	Rolamento 21103-049
Aminoácidos não essenciais	Tecnologias de Vida	Rolamento 11140-050
vitamina C	sigma	Rolamento A4544
β-mercaptoetanol	Tecnologias de Vida	21985023