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1. Cultura de células estaminais embrionárias de ratinho
- Prepare placas ou placas de cultura de células revestidas com gelatina a 0,1%.
- Adicione 2 mL de gelatina esterilizada a 0,1% (0,1% p/v em água) a placas de cultura de células de 60 mm. Balance suavemente para garantir um revestimento uniforme das placas de cultura de células.
- Coloque os pratos em uma incubadora de CO5% 2 a 37 °C e deixe revestir por 1 h.
- Remova a solução de gelatina a 0,1% antes de semear as células.
nota: Após a remoção da gelatina, não há necessidade de secar ou lavar os pratos revestidos.
- Cultura de células-tronco embrionárias de camundongos (A2lox e 129)
- Incubar células mESCs (A2lox e 129) nas placas de cultura de células de 60 mm revestidas com gelatina a 0,1% em meio de crescimento mESC a 37 ° C em uma incubadora de CO5% 2, respectivamente. O meio de crescimento mESC consiste em 85% de meio Eagle modificado por Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12), 15% de reposição de soro knock-out (KSR), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM de GlutaMAX, 1% de aminoácido não essencial (NEAA), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 U/mL de fator inibidor de leucemia (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibidor de GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibidor de MEK).
CUIDADO: β-mercaptoetanol é inflamável e tem toxicidade por inalação. Mantenha-se afastado de fontes de fogo e use uma máscara para evitar a inalação durante o uso.
- Troque o meio de crescimento mESC diariamente para um melhor crescimento de A2lox e 129.
- Quando as células atingirem 80% de confluência, remova o meio e adicione 1 mL de tripsina a 0,1% ao prato. Balance suavemente por 30 s para garantir uma cobertura uniforme de tripsina em todas as células.
- Deixe as células por cerca de 1 min para tripsinizar e, em seguida, remova a tripsina usando uma pipeta de 1 mL.
- Adicione 2 mL de meio de crescimento mESC ao prato, pipete para cima e para baixo várias vezes para fazer uma suspensão de célula única.
- Conte a densidade das células na suspensão com a maior precisão possível usando um hemocitômetro.
- Divida as células em 7 grupos e induza a diferenciação usando diferentes protocolos mostrados na Tabela 1.
2. Diferenciação de mESCs para NPCs
- Prepare placas de cultura de células revestidas com gelatina a 0,1% ou lamínulas.
- Antes de usar, prepare placas ou lamínulas de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1%, como na etapa 1.1.
- Diferenciação (Tabela 1)
- Adicione 1,5 x 106 mESCs em uma placa bacteriana não adesiva em 10 mL de meio de diferenciação basal I para permitir a formação do corpo embrióide a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO2.
- Após 2 dias, transfira os agregados de células para tubos de centrífuga de 15 mL e deixe-os assentar por gravidade.
- Remova o sobrenadante e adicione 10 mL de meio de diferenciação basal fresco I para ressuspender os corpos embrióides. Replante-os em um novo prato bacteriano não adesivo e permita a diferenciação por mais 2 dias.
- Verifique a formação de corpos embrióides ao microscópio (Figura 1A).
- Colete corpos embrióides conforme descrito nas etapas 2.2.2-2.2.3. Semeie cerca de 50 corpos embrióides em 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço em placas de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1%.
- Prepare o estoque de ácido trans-retinóico (RA) de 1 mM (em DMSO) e armazene longe da luz em um freezer a -80 °C após a subembalagem.
nota: A AR é instável e deve-se prestar atenção para mantê-la longe da luz e reduzir o contato com o ar durante a preparação do estoque de AR.
- Para indução de AR, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM.
- Coloque a placa na incubadora de CO5% 2 a 37 °C e diferencie por mais 4 dias.
- Troque todos os 2 mL do meio de diferenciação basal I (com 1 μM RA) a cada 2 dias.
Tabela 1: Detalhes do protocolo utilizado na diferenciação.
| protocolo | mídia |
| Formação de corpos embrióides de 4 dias + indução de AR de 4 dias | Meio de diferenciação basal:
DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
