Diferenciação de células progenitoras neurais em neurônios

Resumo

Fonte: Mao, X., et al. Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias de camundongo in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

O vídeo mostrou um método de cultura de células para diferenciar células progenitoras neurais em neurônios. Ao incubar células em um meio rico em nutrientes suplementado com fatores de crescimento, as células progenitoras amadureceram em neurônios com axônios e dendritos desenvolvidos. Um agente estabilizador garantiu a viabilidade celular e protegeu contra danos oxidativos durante todo o processo de diferenciação.

Protocolo

1. Diferenciação de NPCs para neurônios (Fase II)

1. Semeie cerca de 5 x 10⁵ células-tronco embrionárias de camundongo ou derivados de mESC dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço nas placas de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1%. Divida aleatoriamente os derivados mESC em 3 grupos, como protocolo de Fase II 1, protocolo 2 e protocolo 3, respectivamente.
2. Coloque a placa na incubadora de CO_{5% 2} a 37 °C para permitir a fixação por 6 h. Lave-os duas vezes com 2 mL de PBS.
3. Adicionar 2 mL de meio de diferenciação basal I, N2B27 meio I e N2B27 meio II (Tabela 1), respectivamente, a cada poço dos grupos acima.
4. Coloque as placas na incubadora e deixe-as diferenciar por mais 10 dias. Troque o meio correspondente a cada 2 dias.
5. Verifique o status de diferenciação e registre as alterações morfológicas mencionadas na etapa 3.
6. No dia 18, avalie a geração de neurônios (β-Tubulina III positivo) e determine a eficiência de diferenciação dos 3 protocolos usados na etapa 4.

Resultados

Tabela 1: Detalhes dos 3 protocolos usados na diferenciação da fase II.

Diferenciação Fase II (10d)
	Protocolos	mídia
Protocolo n.º 1	Diferenciação naturalmente: Com o meio de diferenciação basal eu só	Meio de diferenciação ba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-β-tubulina III produzido em coelhos	Sigma Aldrich	T2200	armazenado a -80 °C, evite congelamento e descongelamento repetidos
Suplemento B-27 (50X), sem soro	Gibco	17504044	armazenado a -20 °C e proteger da luz
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	conservado a 4 °C
Soro fetal bovino	HyClone	SH30084.03	armazenado a -20 °C, evite congelamento e descongelamento repetidos
Microscopia de fluorescência	Olimpo	CKX53
gelatina	Gibco	CM0635B	Armazenado em temperatura ambiente
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050061	conservado a 4 °C
Tampão de diluição de anticorpos primários de coloração de imunol	Beyotime	Pág. 0103	conservado a 4 °C
Nocaute DMEM/F-12	Gibco	12660012	conservado a 4 °C
MEM Solução de aminoácidos não essenciais	Gibco	11140076	conservado a 4 °C
Suplemento N-2 (100X)	Gibco	17502048	armazenado a -20 °C e proteger da luz
Soro de cabra normal	Jackson	005-000-121	conservados a -20 °C
Meio Neurobasal	Gibco	21103049	conservado a 4 °C
Prato bacteriano não adesivo	Corning	3262
Solução salina tamponada com fosfato (1X)	HyClone	SH30256.01B	conservado a 4 °C
Solução de penicilina/estreptomicina	HyClone	SV30010	conservado a 4 °C
PD0325901(Mirdametinibe)	Selleck	S1036	conservados a -20 °C
Ácido retinóico	sigma	R2625	armazenado a -80 °C e proteger da luz
Cepa 129 Células-tronco embrionárias de camundongo	Cyagen	MUAES-01001	Mantido em sistema de cultura sem alimentador
2-Mercaptoetanol	Gibco	21985023	armazenado a 4 °C e proteger da luz
4% de paraformaldeído	Beyotime	Pág. 0098	conservados a -20 °C
6 - placa de poço	Corning	3516
Placa de cultura de células de 60 mm	Corning	430166
Tubo de centrífuga de 15 ml	Nunc	Rolamento 339650