Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissociação sensorial dos gânglios
- Pipetar 500 μl de solução de dissociação dos gânglios (GaDS) (Tabela 1), deixando os gânglios no tubo. Lave os gânglios uma vez adicionando 1 ml de solução tampão fosfato (PBS), espere que os gânglios se depositem no fundo do tubo e, em seguida, pipete o PBS.
- Adicionar 1 ml de GaDS e 22 μl de enzima de digestão (mistura de colagenase I/II e protease, 2,5 mg/ml em água) a cada tubo.
- Adicione 20 μl Fast Blue (5,26 mM) ao tubo de controle positivo.
- Coloque os tubos em banho-maria ou bloco de aquecimento regulado para 37 °C.
- A cada 15 minutos, agite os tubos brevemente e agite-os para garantir que os gânglios sejam cobertos pela solução.
nota: O tempo de digestão dos gânglios depende da idade da enzima de digestão. Dentro de um mês após a dissolução da enzima de digestão, digerir por 30 min; dentro de 2 a 6 meses, digerir por 45 min. Se a enzima tiver mais de seis meses, digerir os gânglios por 60 min.
- Enquanto os gânglios estão sendo digeridos, prepare gradientes de densidade usando uma solução de partículas (partículas de sílica coloidal revestidas com polivinilpirrolidona).
- Misture a solução de partículas a 12% em GaDS, 500 μl por amostra.
- Misture a solução de partículas a 28% em GaDS, 500 μl por amostra.
- Adicione lenta e cuidadosamente 400 μl de solução de densidade a 12% sobre 400 μl de solução de densidade a 28% em um tubo novo de 1,5 ml para cada amostra. Não permita que as duas camadas se misturem. Duas camadas distintas devem ser visíveis no tubo, uma mais escura que a outra.
- Após o tempo de digestão adequado, remover o GaDS com a enzima de digestão e lavar os gânglios duas vezes com 1 ml de PBS. Adicione 200 μl de GaDS fresco a cada tubo.
- Use uma pipeta de 200 μl, ajustada para um volume de 100 μl, e pipete os gânglios para cima e para baixo várias vezes para separar as células. Repita até que nenhum pedaço de tecido intacto seja visto. Evite criar bolhas na solução.
- Passe as células dissociadas por um filtro de células de 70 μm.
- Adicione mais 100 μl de GaDS ao tubo de dissociação original para coletar as células perdidas restantes e passar a solução adicional pelo filtro de células. Usando uma nova ponta de pipeta, colete qualquer líquido contendo células restante que tenha passado pelo filtro e se agarrado à malha. O volume final de células suspensas no GaDS é de 300 μl.
- Coloque cuidadosamente os 300 μl de células em cima do gradiente de densidade feito anteriormente. Evite bolhas e mistura de células com as camadas de densidade.
- Centrifugue por 10 min a 2.900 x g em RT.
- Quando a centrifugação estiver concluída, remova e descarte cuidadosamente a camada superior de 700 μl. Esta camada contém a maioria dos detritos celulares que, de outra forma, interfeririam na classificação das células.
- Adicione 700 μl de GaDS fresco à solução restante da célula que contém e pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar.
- 18. Centrifugue por 15 min a 2.900 x g para pellet cells.
- 19. Uma vez feita a centrifugação, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante, deixando o pellet celular.
- Ressuspenda o pellet celular em 200 - 300 μl de GaDS pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μl ajustada para 200 μl várias vezes. Coloque as amostras no gelo.
Tabela 1. Mistura de reagentes para solução de dissociação de gânglios (GaDS).
| ingrediente | quantidade |
| DMEM/f12 avançado | 9,5 ml |
| glutamina | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| Suplemento N2 | 100 μl |
| B27 (sem vitamina A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
