Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
NOTA: O protocolo abaixo descreve o método de preparação e cultura para a incubação de longo prazo e imagens intermitentes de fatias de hipocampo. Uma única fatia do hipocampo é anexada a uma lamínula fotogravada especialmente preparada usando um coágulo de plasma e, em seguida, as lamínulas são seladas no lado plano de um tubo de rolo perfurado, que é mantido em uma incubadora de rolos.
1. Preparação do Roller Tube Rack
- Use o modelo mostrado na Figura 1A impresso no tamanho mostrado na barra de escala. Com um prego, faça pequenos furos (grandes o suficiente para um marcador de ponta fina) no gabarito centralizado nos furos.
- Coloque o modelo no fundo de uma placa de cultura de tecidos de 15 cm (diâmetro nominal de 14 cm) e marque a posição dos orifícios. Repita isso em um segundo prato.
- Com brocas projetadas para uso em plástico, faça seis furos de 1,5 cm de diâmetro em cada prato em uma matriz hexagonal (4,8 cm de centro a centro) com centros de furos a 2,5 cm da borda do prato. Faça três furos (3 mm de diâmetro) a 12 mm da borda que são colocados equidistantes entre dois dos furos maiores, conforme mostrado na Figura 1A.
- Com o fundo de cada prato voltado um para o outro, coloque um parafuso de máquina de 2,5 polegadas de comprimento (3/16 polegadas de diâmetro) com uma arruela plana através de um dos pequenos orifícios seguido por uma segunda arruela plana, um pedaço de tubo de polietileno (espaçador, 4,7 cm), outra arruela plana, a segunda placa de cultura de tecidos, outra arruela plana, uma arruela de travamento, e uma noz.
- Repita a etapa 1.4 nos outros dois parafusos da máquina e aperte apenas frouxamente até que todos os parafusos da máquina estejam no lugar. Em seguida, aperte bem as porcas.
- Trabalhe os ilhós (5/16 de polegada de espessura, diâmetro do orifício de 5/8 de polegada) nos orifícios do prato inferior para obter o suporte final do tubo do rolo (Figura 1B; mostrado com dois tubos no lugar). Coloque um adesivo em cada prateleira com um número exclusivo.
2. Preparação de Tubos de Rolos e Lamínulas
- Fazendo o gabarito para fazer o furo em tubos de rolos
- Faça um furo de 1.5 cm com 8 cm de profundidade no lado central de um bloco de madeira de 2 x 4 x 5.5 polegadas em um ângulo tal que o lado plano do tubo do rolo fique quase paralelo ao bloco quando inserido (Figura 2A).
- Amplie o orifício usando uma lima de madeira redonda para alargar e afunilar o orifício para permitir a inserção do tubo (os tubos de rolos são ligeiramente maiores em diâmetro perto da extremidade da tampa) (Figura 2B).
- Faça um furo vertical de 1,5 cm de diâmetro, a 5,5 cm da lateral do bloco e centralizado sobre o orifício lateral (Figura 2C).
- Quando o orifício lateral estiver afunilado o suficiente, insira um tubo de rolo marcado no local desejado para centralizar o orifício para a fatia e posicione o tubo de forma que o ponto marcado fique centralizado no orifício vertical de 1.5 cm.
- Remova o tubo e meça a distância do local até a extremidade do tubo. Marque esta distância do centro do orifício no gabarito e insira um prego para fornecer um batente para posicionar corretamente o tubo para perfuração (seta na Figura 2C).
- Use uma serra para cortar o prego nivelado com a superfície do bloco de madeira para evitar ferimentos.
- Adicione clipes de mola na parte inferior do gabarito se houver uma furadeira com ranhuras que permitam que ela seja ancorada (Figura 2D seta preta). Caso contrário, use grampos C para segurar o gabarito com segurança na furadeira.
- Usando o gabarito descrito acima para segurar e posicionar um tubo de cultura de plástico de 11 cm de lado plano com o lado plano para cima (Figura 2A), faça um furo de 6 mm de diâmetro com o centro a 1,0 cm do fundo e centralizado entre os lados do tubo.
nota: Deve ser usada uma broca projetada para plástico.
- Com uma ferramenta de rebarbação giratória, alise as bordas do furo (Figura 2E) e faça 4 ranhuras na borda interna do furo (Figura 2E, inserção) para facilitar a drenagem do furo durante a rotação.
- Com um furador de 12 mm, corte discos de 12 mm de diâmetro de folhas de borracha de silicone adesiva dupla face não tóxicas. Usando um furador de papel padrão de um furo (6 mm de diâmetro), faça um furo no centro de cada disco.
- Enxágue os tubos perfurados com etanol a 70%, seque-os ao ar em uma cabine de segurança biológica e esterilize os tubos e os discos adesivos perfurados por 40 min sob a lâmpada ultravioleta (UV) (30 W a 70 cm de distância média) na cabine de segurança biológica.
- Reposicione os tubos e discos após 20 min para que todas as superfícies expostas sejam esterilizadas. Em condições estéreis, retire o suporte branco de um disco adesivo e fixe a borracha de silicone na parte externa de um tubo, alinhando os orifícios (Figura 2F).
cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use proteção para os olhos e feche o gabinete antes de ligar a lâmpada UV.
- Limpe lamínulas de vidro alemão fotogravadas de 12 mm de diâmetro (100 quadrados de 1 mm numerados no centro). Segure as lamínulas suavemente com uma pinça e mergulhe em etanol absoluto, seguido de água, seguido de etanol absoluto novamente e, finalmente, mergulhe as lamínulas em uma chama para queimar o etanol. Deixe as lamínulas esfriarem.
- Segurando as lamínulas com uma pinça, mergulhe em 3-aminopropiltrietoxissilano a 2% em acetona por 10 s. Enxágue as lamínulas com água ultrapura e deixe secar ao ar.
- Coloque as lamínulas em papel de filtro estéril dentro de um armário de segurança biológica e acenda a luz ultravioleta. Exponha cada lado das lamínulas por 20 min.
cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use proteção para os olhos e feche o gabinete antes de ligar a lâmpada UV.
3. Preparação da fatia do hipocampo
- Antes de iniciar a dissecção, prepare metades de lâminas de barbear de dois gumes para o picador de tecido. Dobre as lâminas longitudinalmente com os dedos e quebre ao meio.
- Enxágue as metades da lâmina com acetona usando um cotonete para limpá-las, seguido de enxágue com etanol absoluto e secagem ao ar. Antes de montar uma meia lâmina no picador de tecidos, esterilize-o enxaguando com etanol a 70%.
- Siga os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da instituição; após a anestesia com isoflurano, eutanasiar um filhote de camundongo ou rato de 4 a 7 dias de idade por decapitação e remover a cabeça com tesoura ou guilhotina.
nota: O protocolo de cultura de fatias de cérebro é independente da cepa ou genótipo de camundongo ou rato. Muitas linhagens de camundongos transgênicos com diferentes origens genéticas foram usadas.
- Enxágue a cabeça com etanol a 70% e coloque-a em uma placa de Petri de 60 mm. Até a montagem final da fatia do cérebro no tubo do rolo, todas as etapas a seguir são executadas em uma capela de fluxo laminar para manter a esterilidade.
- Usando uma lâmina cirúrgica # 21, faça um corte sagital na pele e no crânio. Com uma pinça Dumont # 5, retire a pele e o crânio para expor o cérebro.
- Com uma pinça fechada, retire suavemente todo o cérebro, liberando-o beliscando com a pinça através do tronco cerebral atrás do cerebelo. Coloque o cérebro em um prato estéril de 60 mm contendo 4 ° C Gey's Balanced Salt Solution/0.5% glicose (GBSS/glicose).
- Usando um microscópio de dissecção para visualizar o cérebro (Figura 3A), coloque o lado dorsal do cérebro para cima e corte o terço frontal do cérebro e o cerebelo com uma lâmina cirúrgica (Figura 3B).
- Com uma pinça, segure o lado posterior do cérebro aparado para cima e o lado ventral contra o lado da placa de Petri para estabilidade. Retire suavemente as meninges ao redor da linha média sagital e remova o tecido do mesencéfalo usando uma pinça Dumont # 5 de ponta fina (Figura 3C, círculo tracejado).
- Faça dois cortes ao longo do lado do cérebro para abri-lo (Figura 3C, linhas tracejadas). Uma vez que o cérebro é colocado com o lado dorsal voltado para baixo e aberto, a fissura hipocampal deve ser visível (Figura 3D, seta).
- Transfira o cérebro aberto espalhado para um pedaço de filme plástico de policlorotrifluoretileno e posicione-o para fatiar no palco de um picador de tecido. Molhe a lâmina com GBSS/glicose e pique o hipocampo em fatias de ~ 300 μm de espessura.
- Com uma pipeta de transferência, lave o cérebro cortado do filme plástico em um novo prato de 60 mm contendo GBSS / glicose ( Figura 3E ). Aperte suavemente e retire, com uma pinça de ponta fina, as meninges restantes e outros tecidos não hipocampais (Figura 3F) das fatias (Figura 3G, H).
4. Fatias de revestimento
- Uma vez obtidas as fatias, coloque 2 μL de plasma de galinha no centro do lado fotogravado de uma lamínula preparada. Espalhe o plasma levemente para obter um ponto de 3-4 mm de diâmetro.
nota: O lado fotogravado é o lado superior da lamínula quando visto através de um microscópio de dissecação, de modo que os números sejam orientados corretamente.
- Transfira 1 fatia de cérebro com uma espátula estéril de ponta estreita ( Figura 4A ) para o ponto de plasma ( Figura 4B ). Use uma pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia do GBSS/glicose.
- Toque a espátula no ponto de plasma na lamínula e, com uma pinça fechada, empurre a fatia para a lamínula.
- Misture 2,5 μL de plasma com 2,5 μL de trombina em um tubo separado. Coloque rapidamente 2,5 μL desta mistura sobre e ao redor da fatia e pipete para cima e para baixo suavemente para misturá-la (Figura 4B).
nota: O plasma coagulará dentro de 10 a 15 s, portanto, isso deve ser feito rapidamente. Se a adesão da fatia for um problema, misture 5 μL de plasma com 5 μL de trombina e use 4-5 μL na fatia, removendo um pouco após a mistura para que a fatia fique plana na lamínula.
- Remova a cobertura plástica transparente do lado exposto do adesivo de borracha de silicone previamente afixado a um tubo de rolo e coloque a lamínula com a fatia de cérebro no adesivo alinhando a fatia dentro do orifício (Figura 4C).
- Para garantir a aderência, aplique uma pressão suave e uniforme na lamínula com o polegar, pressionando a lamínula uniformemente e segurando-a por cerca de 1 min enquanto a transfere para o gabinete de segurança biológica.
- Em uma cabine de segurança biológica, adicione 0,8 mL de meio de cultura Neurobasal A completo (Tabela de Materiais) a cada tubo (Figura 4D).
- Flua uma mistura de ar a 5% de CO2/95% através de uma pipeta Pasteur estéril com plugue de algodão, presa com segurança por uma braçadeira. Lave o tubo do rolo com a mistura de gases e tampe rapidamente o tubo à medida que é retirado ao redor da pipeta.
- Rotule os tubos com o número da fatia e o número do rack. Insira os tubos em um rack de rolos, garantindo que estejam geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione tubos para equilibrar.
- Coloque os racks em uma incubadora de rolos a 35 °C com rolos girando o rack de rolos a cerca de 10-13 rotações por hora (RPH) (Figura 4E). Para manter o meio no fundo dos tubos, incline a incubadora para trás aproximadamente 5° levantando sua frente em uma placa.
