1. Padronização de Culturas Neuronais Usando Dispositivos Microfluídicos: Montagem de Dispositivos
- Selecione um dispositivo microfluídico adequado para o experimento desejado. Para conectar neurônios dentro da mesma população, use os Neuro Devices (Figura 1) e, para conectar neurônios em diferentes populações, use os Co-Culture Devices (Figura 2).
- Limpe e prepare o número desejado de lamínulas estéreis ou pratos com fundo de vidro. Para obter melhores resultados em superfícies plásticas, use pratos de 35 mm, em vidro, use lamínulas de 25 mm ou pratos com fundo de vidro de 35 mm. Selecione a espessura do vidro com base no sistema de imagem, por exemplo, 0,15 mm.
- Cubra a louça ou lamínulas com 0,5-1 mL de 100 μg/mL PDL por 2 h ou durante a noite em temperatura ambiente.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte, se desejado. Além disso, os pratos podem ser revestidos com PDL diluído em tampão borato, poli-L-lisina (PLL), laminina ou qualquer outra molécula de adesão celular.
- Lave a louça duas vezes com água (não use solução salina tamponada com fosfato (PBS), pois os cristais de sal podem bloquear os canais), remova todo o líquido e deixe secar em um ambiente estéril, como uma cabine de biossegurança, por 5 a 10 min ou até que a superfície esteja completamente seca.
nota: Tenha cuidado para garantir que as lamínulas estejam absolutamente secas, pois qualquer líquido restante interferirá na aderência dos sistemas microfluídicos.
- Coloque dispositivos microfluídicos com padrões voltados para cima sob luz UV em um ambiente estéril (gabinete de biossegurança) por 10 min. Certifique-se de seguir os procedimentos estéreis ao trabalhar no gabinete de biossegurança10.
- Usando uma pinça, coloque um dispositivo microfluídico com um padrão voltado para baixo em contato com a lamínula/prato limpo. Use a pinça para pressionar suavemente o dispositivo para que ele adira ao vidro.
nota: A transparência da região aderida será visível ao olhar contra a luz. Certifique-se de que todos os cantos estejam em contato com o vidro. Faça isso com todos os dispositivos microfluídicos. Veja a Figura 1a.
- Para encher o dispositivo de população única com meio, aponte a pipeta para os canais e adicione 50 μL de meio celular completo suplementado com B-27 sem soro (proporção de volume 1:50) e 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina (coletivamente chamados de NBM) ao poço superior direito e, em seguida, adicione mais 50 μL ao poço que está na diagonal a ele. Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos dois poços restantes. Veja a Figura 3a.
- Para encher o dispositivo de população múltipla com meio, aponte a pipeta para os canais e adicione 30 μL de NBM completo aos poços certos, consulte a Figura 2a. Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos quatro poços restantes.
- Coloque os dispositivos em uma placa maior com um prato aberto com água autoclavada (câmara úmida) e coloque na incubadora (37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade) por 1-2 h enquanto prepara a cultura de células. Veja a Figura 3b.
2. Neurônios de revestimento em sistemas microfluídicos
- Seguindo um protocolo, obtenha neurônios hipocampais ou corticais dissociados de embriões de ratos Sprague Dawley (ambos os sexos).
- Ressuspenda neurônios embrionários em NBM a uma concentração de 1-2 milhões de neurônios / mL. Verifique as concentrações de células no microscópio usando um hemocitômetro e seguindo a referência8. Ajuste a concentração celular de acordo com a densidade celular desejada. Para aumentar as chances de obter axônios únicos do hipocampo por canal, coloque 10.000 neurônios por dispositivo. Para ter vários axônios no mesmo canal, coloque 60.000 neurônios por dispositivo.
Nota: Esses números variam de acordo com o tipo neuronal usado.
- Remova o meio dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços. Deixe aproximadamente 5 μL em cada um.
- Para plaquear células no dispositivo de população única, adicione 50 μL de NBM ao poço inferior direito. Nesse ponto, o meio flui sozinho para encher o outro poço inferior. Adicione 20 μL da solução de célula concentrada no poço superior direito do dispositivo microfluídico, conforme indicado na Figura 1b.
- Para plaquear as células no dispositivo de população múltipla, adicione 20 μL da solução de células concentradas em cada um dos poços corretos na Figura 2a.
- Verifique no microscópio se as células estão dentro das câmaras e coloque os dispositivos na incubadora por 15 a 30 minutos para promover a fixação das células ao substrato.
- Verifique no microscópio se há células suficientes nas câmaras. Se forem necessários mais, repita as etapas 2.4 e 2.5.
- Adicione 50 μL de NBM aos 2 poços superiores do dispositivo de população única e 20 μL de NBM no mesmo poço em que as células foram injetadas no dispositivo de população múltipla. A mídia se projeta ligeiramente para formar um menisco positivo, dando aos poços um aspecto de topo de muffin. Novamente, consulte a Figura 3a.
- Mantenha as células a 37 °C, 5%CO2 e 95% de umidade.
3. Manutenção das Culturas Neuronais
- Remova o NBM (aproximadamente 30 μL com uma pipeta) das células e aplique o novo NBM pré-aquecido no dia seguinte à sua introdução nos dispositivos (ou seja, 1 dia após a etapa 2).
- Verifique a cada 2 dias se há mídia suficiente em cada canal. Se a parte superior do muffin estiver baixa, basta adicionar mais meio aos poços superiores.
- Células de cultura por pelo menos 7 dias antes da remoção dos dispositivos microfluídicos. As células podem sobreviver nesses dispositivos por várias semanas. Remova os dispositivos 1-2 dias antes dos experimentos serem realizados nas amostras.
4. Remoção de dispositivos microfluídicos
- 1 - 2 d antes da remoção dos dispositivos microfluídicos, adicione 2 mL de NBM pré-aquecido a 37 ° C a cada prato de amostra, inundando as câmaras e mantenha os dispositivos na incubadora.
- Use uma pinça estéril e uma ponta para remover os dispositivos microfluídicos das lamínulas, deixando uma configuração padronizada de neurônios. Use a ponta para segurar a lamínula no lugar e a pinça para prender a borda do dispositivo no canto inferior esquerdo do poço. Aplique delicadamente a torção, levantando o dispositivo com a pinça para que ele se solte da lamínula. Veja a Figura 3c-3d.
- A cada 2-3 dias, substitua metade do NBM até que a amostra seja usada para experimentos.
- Antes de realizar experimentos de religação na amostra, verifique se os neuritos nos canais do dispositivo de população única e as populações neuronais no dispositivo de população múltipla estão isolados examinando as lacunas entre eles no microscópio para garantir que não haja filamentos ligando as populações neuronais.
5. Preparando contas revestidas com PDL
- Adicione 2 gotas de 50 μL de esferas de poliestireno de 4, 10 ou 20 μm diluídas em água (1:500) a 1 mL de PDL (100 μg/mL). Deixe por pelo menos 2 h em temperatura ambiente.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte.
- Centrifugue a solução a 8.820 x g durante 1 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os grânulos acumulados no fundo do recipiente.
- Lave as esferas duas vezes com 1 mL de solução estéril 10 mM HEPES pH 8.4
.
- Ressuspenda os grânulos revestidos com PDL em 200 mL de solução HEPES pH 8,4 10 mM.
6. Preparando micropipetas
- Prepare pipetas a partir de tubos capilares de vidro (1 mm de diâmetro interno, 1,5 mm de diâmetro externo) usando um extrator de eletrodo horizontal. Ajuste as configurações para que a ponta externa da micropipeta puxada seja ~ 2-5 μm. Antes de puxar, certifique-se de que os tubos de vidro estejam limpos.
- Fixe as pipetas nas lâminas de vidro para armazenamento e certifique-se de que a ponta não entre em contato com a superfície da lâmina, pois a ponta é frágil. Armazene em temperatura ambiente em um recipiente coberto para proteger da poeira. Use pipetas no mesmo dia em que são puxadas.
7. Adesão de grânulos PDL aos neurônios
- Adicione 40-60 μL de esferas revestidas com PDL preparadas na etapa 5 a uma cultura de células preparada na etapa 4. Centralize a ponta da pipeta sobre os neurônios, que são levemente visíveis na lamínula, e adicione as contas (veja a Figura 4).
- Retorne a amostra à incubadora por 1 h para promover a formação de contatos sinápticos.
- Após a incubação, remova quaisquer contas não aderidas lavando suavemente a cultura com NBM pré-aquecido.
8. Preparando Solução Salina Fisiológica (para Experimentos à Temperatura Ambiente)
- Prepare uma solução salina fisiológica. Isso é para regular o ambiente celular fora da incubadora.
- Verifique os níveis de osmolaridade e pH.
- Infundir continuamente a solução com O2 para minimizar as flutuações de pH durante a realização de experimentos.
- Aqueça à temperatura ambiente.
- Configure o sistema de perfusão inserindo uma extremidade de um tubo de plástico (dimensões opcionais) em uma solução fisiológica com infusão de O2 e fixando a outra extremidade a uma agulha inserida no porta-amostras. Coloque o tubo e a solução mais altos do que a amostra (veja a Figura 5).
- Desconecte o tubo da agulha e conecte-o a uma seringa. Use a seringa para exercer pressão e aspirar líquido, enchendo o tubo. Sele com um grampo de rolo e reconecte a agulha.
9. Micromanipulação de contas
- Instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser acessadas de cima por duas micropipetas montadas em micromanipuladores e acessadas opticamente abaixo, por exemplo, com a objetiva de fase 40X (abertura numérica de 0,6) de um microscópio óptico invertido. Nesta configuração, monte uma câmera CCD para captura de imagem na porta lateral do microscópio. Conecte cada pipeta a seringas de 1 mL por meio de um tubo de plástico. Nesta etapa, substitua o NBM por uma solução salina fisiológica (1-2 mL) (ver Figura 5).
- Durante os experimentos, perfundiu continuamente as células com a solução salina fisiológica preparada na etapa 8 a uma taxa de 0,5-1 mL / min.
- Selecione um cordão PDL NÃO ligado a um neurônio no campo de view. Alinhe o cordão com uma ponta de micropipeta concentrando-se no cordão e depois até a micropipeta. Abaixe a ponta o mais próximo possível do cordão, monitorando-o ao microscópio.
- Aplique pressão negativa com a seringa de 1 mL conectada à pipeta para pegar o grânulo. Mantenha a pressão negativa durante todo o experimento.
10. Puxando neurites
- Selecione um cordão PDL ligado a um neurônio no campo de view e conecte-o à segunda micropipeta usando sucção conforme descrito nas etapas 9.3-9.4.
- Puxe o complexo PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min), movendo o micromanipulador ou o estágio de amostra em 1 μm e pausando por 5 min para permitir a iniciação do neurite.
- Repita a etapa 10.2 duas vezes.
Nota: Os primeiros 3 μm devem ser puxados muito lentamente para garantir o sucesso experimental, que ocorre em mais de 95% das vezes.
- Puxe o complexo PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) movendo o micromanipulador ou o estágio de amostra em 2 μm e faça uma pausa de 5 min para permitir o alongamento do neurite.
- Após a iniciação bem-sucedida e a extensão do neurite nos primeiros 5 μm, puxe o neurite a 20 μm/min em distâncias em escala milimétrica.
Nota: A tração pode ser realizada continuamente ou em etapas e em taxas variadas. Veja a Figura 6b-6c.
11. Conectando neurônios
- Selecione uma região rica em neuritos e diminua o complexo PDL-bead-neurite para que ele entre em contato fisicamente com ele. Use outras contas para medir a altura da ponta acima da superfície da lamínula. Veja a Figura 6d.
- Deixe o complexo PDL-bead-neurite em contato com o neurite alvo enquanto manipula a segunda micropipeta. Abaixe a segunda pipeta com o segundo cordão PDL sobre o neurite recém-formado a cerca de 20 μm do primeiro cordão. Use o segundo cordão PDL para empurrar o novo filamento de neurite em direção à célula-alvo.
- Mantenha ambas as contas no lugar por pelo menos 1 h. Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neuritos em contato com a conta, com o microscópio 16 .
- Durante esse tempo, use a perfusão para mudar lentamente o meio da amostra de solução salina fisiológica para NBM pré-aquecido com CO2.
- Solte o cordão da segunda pipeta liberando a sucção. Se o novo neurite permanecer preso, solte também o primeiro cordão. Veja a Figura 6e .
- Remova suavemente a solução salina e substitua por NBM (~ 2 mL).
- Coloque cuidadosamente a amostra de volta na incubadora para fortalecer a conexão neuronal para experimentos futuros. Esta conexão é estável por >24
