Geração de neurônios por reprogramação de células de fibroblastos dérmicos humanos

Resumo

Fonte: Shrigley, S., et al. Geração simples de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidos a partir de fibroblastos de pele humana adulta. J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra a geração de neurônios a partir de fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDFs). Os aHDFs são reprogramados usando um vetor lentiviral que transporta genes para fatores de transcrição neuronal e RNAs de grampo curto (shRNAs). Os shRNAs inibem a expressão de um repressor transcricional neuronal, e os fatores de transcrição neuronal ativam genes para diferenciar aHDFs em neurônios. Esses aHDFs reprogramados são cultivados em um meio de conversão neuronal precoce e tardia para gerar neurônios maduros.

Protocolo

1. Preparação de fibroblastos cutâneos para reprogramação

1. Usando um sistema automatizado de descongelamento celular ou um banho-maria a 37 ° C, descongele os fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDFs) e coloque 200.000 por frasco T75 (conte com um contador de células automatizado) em 10 mL de meio de fibroblasto (ver Tabela 1) a 37 ° C em 5% CO₂.
2. Realize uma troca completa do meio com meio de fibroblastos no dia seguinte.
3. Troque o meio de fibroblastos a cada 3–4 dias até que as células atinjam 95% de confluência.
   nota: Um frasco confluente conterá aproximadamente 1.000.000 de células.

2. Revestimento para Reprogramação (Dia −1)

NOTA: Recomenda-se o uso de um revestimento de gelatina para experimentos de curto prazo (até 30 dias); alternativamente, para experimentos de longo prazo, recomenda-se iniciar um revestimento de poli-L-ornitina, fibronectina e laminina (PFL).

1. 60 min antes de plaquear os aHDFs para reprogramação, cubra uma placa de 24 poços com gelatina a 0,1% (250 μL / poço) e incube a 37 ° C.
2. Aspire o meio de fibroblastos nos aHDFs. Lave uma vez com solução salina tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Dissocie as células com tripsina a 0,05% (1,5 mL por frasco T75) a 37 ° C por 3-5 min.
3. Adicione meio fibroblasto para neutralizar a tripsina (3 mL por descarga por frasco T75) e colete as células destacadas em um tubo de 15 mL, lavando as células do frasco duas vezes.
4. Gire as células a 400 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de fibroblasto.
5. Conte as células usando um contador de células automatizado (para garantir uma conversão de boa qualidade, verifique se a viabilidade celular está acima de 90% com coloração com azul de tripano).
6. Para uma placa completa de 24 poços, prepare uma suspensão de 1.320.000 células em 13,2 mL de meio de fibroblastos para obter uma suspensão de 100.000 células/mL de meio (ou 55.000 células/poço em 550 μL de meio de fibroblastos multiplicado pelo número de poços necessários).
7. Aspire a gelatina da placa e lave duas vezes com DPBS. Adicionar 500 μL da suspensão celular a cada poço e incubar durante a noite a 37 °C em CO_{2% a} 5%.

3. Transdução Viral (Dia 0)

NOTA: Trabalhar com partículas lentivirais requer equipamento de categoria 2 e o uso de um agente para neutralizar o vírus. O uso de pares duplos de luvas também é fortemente recomendado.

1. Aqueça 13,2 mL de meio de fibroblastos a 37 °C.
2. Descongele um vetor lentiviral contendo os fatores de transcrição achaete-scute família bHLH fator de transcrição 1 (Ascl1) e Brn2 com dois RNAs de grampo curto (shRNA) direcionados ao fator de transcrição silenciador de RE1 (REST) à temperatura ambiente.
3. Adicionar o volume necessário de lentivírus para infectar as aHDFs em multiplicidade de infecção (MOI) de 20 ao meio sem nenhum intensificador de transdução.
   
4. Substitua o meio na placa de 24 poços por meio de fibroblastos contendo o vetor lentiviral (500 μL / poço) e incube durante a noite a 37 ° C em 5% de CO₂.
5. No dia seguinte, substitua o meio nos poços por meio de fibroblastos fresco sem o vetor lentiviral.
   nota: O meio é considerado infeccioso por 7 dias e, como tal, procedimentos adequados de proteção e manuseio devem ser usados durante a primeira semana após a transdução viral.

4. Manutenção das células de conversão

NOTA: Uma vez iniciada a conversão, as células são suscetíveis ao levantamento; tome cuidado para inclinar a placa para cima e use uma pipeta de 1.000 μL ao remover o meio para evitar o desprendimento das células.

1. No dia 3, remova o meio de fibroblastos e adicione 500 μL de meio de conversão neuronal inicial (ver Tabela 1).
2. Duas a três vezes por semana, retire 225 μL de meio antigo do poço e adicione 250 μL de meio de conversão neuronal inicial fresco.
3. No dia 18, remova todo o meio de cada poço e substitua por 500 μL de meio de conversão neuronal tardia (ver Tabela 1).
4. Continue a mudar metade do meio como acima com o meio de conversão neuronal tardia a cada 2-3 dias até o dia 25 ou ponto final do experimento (Figura 1A).

Tabela 1. Composição dos diferentes meios utilizados. Descrição completa da composição dos meios necessários neste protocolo, incluindo meio de fibroblastos, meio de conversão neuronal inicial, meio de conversão neuronal tardia.

	Concentração de Ações	Concentração de trabalho
Meio de fibroblastos
Meio basal	N/A	N/A
Penicilina/estreptomicina	10.000 U/mL	100 mg/ml
FBS	N/A	10% de sucesso
Meio de conversão neuronal precoce (ENM)
Meio de diferenciação neural	N/A	N/A
Penicilina/estreptomicina	10.000 U/mL	100 mg/ml
CHIR99021	10 mM	2 μM
SB-431542	20 mM	10 μM
Cabeça	100 μg/mL	0,5 μg/mL
LDN-1931189	10 mM	0,5 μM
VPA	1 milhão	1 mM
LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM
Meio de conversão neuronal tardia (LNM)
Meio de diferenciação neural	N/A	N/A
Penicilina/estreptomicina	10.000 U/mL	100 mg/ml
LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM

Resultados

Figura 1: Evolução da conversão iN ao longo do tempo.(A) Linha do tempo do experimento e mapa da construção embalada em um lentivírus usado para reprogramar os fibroblastos dérmicos humanos adultos. Cada seta preta representa uma alteração média. (B) Imagens representativas de contraste de fase representando as mudanças na morfologia das células durante o processo de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhas celulares
Fibroblastos dérmicos humanos adultos			[C2 passagem # 7] O doador era uma mulher de 67 anos. Células obtidas nas clínicas de Pesquisa da Doença de Parkinson e Doença de Huntington no John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, Reino Unido).
Reagentes para cultura, transdução e conversão de fibroblastos
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
Tripsina-EDTA [0,5%]	Gibco	Rolamento 15400-054	Diluir a 0,05% em DPBS.
Virkon (agente usado para neutralizar o vírus)	Viroderma	Nº 7511	Dilua para solução a 1% com água morna.
Água Milli-Q	Millipore
Meio basal - Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + GlutaMax	Gibco	61965059
Penicilina/estreptomicina [10.000 U/mL]	Gibco	15140-122
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	10270-106
CryoMACS® dimetilsulfóxido (DMSO) 10	Miltenyi	170-076-303
Meio de diferenciação neural - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
LM-22A4	Tocris	Nº 4607	Diluir 10 mg em 1450 μL de DMSO. Concentração de estoque: 20 mM.
Fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF) [humano recombinante]	Sistemas de P&D	212-GD-010	Diluir 10 ug em 500 μL de BSA a 0,1% em DPBS. Concentração de estoque: 20 μg/mL.
NT3 [humano recombinante]	Sistemas de P&D	267-N3-025	Diluir 25 μg em 2,5 mL de BSA a 0,1% em DPBS. Concentração de estoque: 10 μg/mL.
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	Diluir 1 g em 40,7 mL de água Milli-Q. Filtrar e fazer alíquotas de 500 μL ou tubos de reserva de 10 ml. Concentração de estoque: 50 mM.
CHIR99021	axónio	1386	Diluir 2 μg em 429,8 μL DMSO. Concentração de estoque: 10 mM.
LDN-193189	axónio	1509	Diluir 2 mg em 360 μL de DMSO. Concentração de estoque: 10 mM.
Sal de sódio do ácido valpróico (VPA)	Merck Millipore	Nº 676380	Diluir 5 g em água Milli-Q para atingir uma concentração de estoque de 1 M. CUIDADO: Evite a ingestão, o contato com a pele e a formação de poeira respiratória.
Reagentes para revestimentos
gelatina	Sigma Aldrich	G2500	Diluir a 0,1% em água Milli-Q.
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	Pág. 3655	Dissolva em água Milli-Q. Use a 15μg/mL.
Fibronectina	ThermoFisher Scientific	Rolamento 33010-018	2 mL de água Milli-Q + 70 μL 0,25 M NaOH. Use a 5 μg / mL.
Laminina	ThermoFisher Scientific	Rolamento 23017-015	Conservar a -80°C. Descongelar no gelo, manter fresco e alíquota 30 μL. Utilizar a 5 μg/ml.
equipamento
Frasco T75 [Nunclon Delta Surface]	ThermoFisher Scientific	156499
Placa de 24 poços [Nunc]	ThermoFisher Scientific	142485
Tubo de polipropileno de 1,5 mL	Sigma Aldrich	Z336769
Tubo de falcão de 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Tubo de falcão de 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
Controlador Pippette			Para volumes de pipetagem de 1 a 25 mL.
Pipetas sorológicas estéreis: 5, 10 e 25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Pipetadores de volume ajustáveis: 5, 20, 200 e 1.000 μL
Ponteiras de pipeta estéreis			Para volumes de pipetagem de 0,5 - 1.000 μL.
Sistema automatizado de descongelamento de células ThawSTAR	BioCision	BCS-601
Contador de Células Automatizado Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Câmaras de contagem de células [50 lâminas] e azul de tripano [0,4%]	ThermoFisher Scientific	C10228	Para uso com o Contador de Células Automatizado Countess II.
Capa de fluxo laminar
Incubadora umidificada de 5% CO2 37 °C
centrifuga			Adequado para tubos de 1,5, 15 e 50 mL.
Agitador orbital
Microscópio de fluorescência invertida	Leica	DMI6000 B