Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação pré-fatiamento
- Prepare os meios de "processamento de tecidos" e os meios de "manutenção da cultura de fatias" um dia antes da ressecção planejada do tumor e da coleta de tecidos (ou utilize os meios gerados anteriormente dentro de 2 semanas). Adicione 5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 U / mL) e 5 mL de ácido 1 M 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES) a 500 mL de um meio Eagle modificado de Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM) para gerar o meio de processamento de tecidos.
- Prepare 250 mL de meio de manutenção de cultura de fatias usando uma base de meio neuronal (por exemplo, Neurobasal) sem vermelho de fenol. Suplementar este meio com HEPES 10 mM, 1x suplemento B-27, 400 μM L-glutamina, 600 μM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo, 60 U/mL de penicilina, 60 μg/mL de estreptomicina e 6 U/mL de nistatina.
- Armazene todos os suportes a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
2. Dia da Cirurgia: Aquisição de Tecido
- No dia da aquisição do tecido, prepare 50 a 100 mL de soluções a 1% e 2% (peso / vol%) de agarose de baixa temperatura de fusão em meios de processamento de tecidos usando vidraria autoclavada e técnica estéril em uma capela de fluxo laminar. Ambas as concentrações de agarose são necessárias para acomodar a variação imprevisível na consistência do tecido tumoral.
- Aqueça a suspensão de agarose, usando um micro-ondas, até observar uma leve fervura. Colocar a solução de agarose num banho-maria a 37 °C para manter no estado líquido até à utilização.
- Coloque 1 mL de meio de manutenção de cultura de fatias em cada poço de uma placa de 6 poços.
- Use uma pinça estéril para colocar inserções de cultura de politetrafluoretileno (PTFE) vazias em cada poço. Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada com camisa de água com uma atmosfera de CO5% 2 mantida a 37 ° C.
- Usando uma pipeta Pasteur estéril em uma capela de fluxo laminar, borbulhe uma mistura de gás 95% O2/5% CO2 em um frasco contendo meio de processamento de tecido gelado por aproximadamente 15 a 30 min, antes da aquisição do tecido tumoral. O uso de meios supraoxigenados minimiza a hipóxia no tecido a granel durante o processamento.
- Prepare tubos cônicos de 50 mL rotulados (o suficiente para o número desejado de regiões tumorais individuais a serem isoladas) contendo alíquotas de 20 mL de meios de processamento gelados supra-oxigenados para transportar o tecido entre a sala de cirurgia e a instalação de fatiamento.
- Em conjunto com um neurocirurgião, planeje no pré-operatório a região do tumor para aquisição da amostra. Selecione uma região tumoral com realce de contraste, conforme demonstrado na imagem clínica do paciente (sequências de ressonância magnética (RNM) pós-gadolínio T1). A experiência anterior sugere que essa área produz tecido tumoral viável em oposição ao tecido necrótico.
nota: A geração de fatias da substância branca circundante (peritumoral) foi tentada; no entanto, a autofluorescência de fundo e a diminuição da densidade de células tumorais limitaram a utilidade experimental dessas fatias.
- Obtenha tecido tumoral no início da ressecção do tumor. Evite a coleta de tecido tumoral exposto a cautério bipolar extenso, que pode comprometer a viabilidade tecidual secundária à lesão térmica. Amostras de tecido adquiridas durante a ressecção fragmentada do tumor demonstram maior viabilidade quando comparadas ao tecido adquirido de ressecções longas em bloco. Essa observação pode estar relacionada à privação diferencial do fluxo sanguíneo do tecido tumoral como resultado da ressecção cirúrgica e ao tempo prolongado para aquisição.
- Se desejar, rotule e armazene o tecido tumoral em tubos cônicos separados para isolar amostras de regiões tumorais distintas. (ou seja, tecido tumoral superficial vs. profundo). A localização precisa dos tecidos pode ser registrada se/quando a navegação cirúrgica intraoperatória estiver disponível.
3. Preparação da cultura de fatias
- Coloque pedaços de tecido tumoral em uma placa de Petri com meio de processamento gelado. Para lavar o tecido tumoral e minimizar os glóbulos vermelhos aderentes, use uma pipeta para trocar e descartar suavemente a mídia na placa de Petri três vezes.
- Usando um bisturi, corte os pedaços do tumor em formas de caixa retangular. Apare os pedaços de tecido para aproximadamente 3 mm x 3 mm x 10 mm. Remova cuidadosamente todos os vasos presos por meio de excisão ou tração suave com pinças finas.
- Pipete 5 - 7 mL de agarose a 37 ° C em um pequeno molde de incorporação de plástico em forma de cubo (~ 2 cm3). Confirme a temperatura da solução de agarose não superior a 37 °C com um termômetro estéril antes de usar.
- Deixe a agarose descansar por aproximadamente 1 min em uma cama de gelo.
- Coloque 2 a 4 "tiras" de tecido tumoral na agarose com o eixo longo orientado verticalmente. nota: As tiras de tecido tendem a "afundar" na agarose antes da solidificação. Para evitar essa complicação, segure temporariamente a tira de tecido na orientação vertical até que a agarose esteja ainda mais solidificada.
- Mantenha o tecido contendo o molde de agarose em uma cama de gelo por 2 a 5 minutos para facilitar a solidificação.
- Remova o mofo do gelo e remova suavemente o bloco de agarose cortando as laterais da forma com um bisturi. Evite colocar força excessiva no bloco, o que pode fraturar a agarose.
- Use uma gota generosa de cola de cianoacrilato para fixar o bloco de agarose na placa de amostra do vibratomo. Deixe a cola endurecer por aproximadamente 1 - 2 min.
- Encha o reservatório do vibratomo com meios de processamento gelados para submergir o bloco de agarose afixado na placa de amostra.
- Durante o fatiamento, borbulhe a mistura de gás 95% O2 / 5% CO2 no reservatório de vibratome através de uma pipeta de plástico estéril aparada.
- Defina a espessura da fatia do vibratomo para 300 - 350 μm.
- Ajuste a velocidade de avanço da lâmina e a amplitude da lâmina de acordo com a consistência do tecido. O tecido de glioblastoma "mais rígido" requer velocidades de avanço da lâmina mais lentas e maior amplitude. As configurações exatas de velocidade e amplitude da lâmina variam de acordo com as especificações do vibrato.
nota: Vários problemas geralmente surgem durante o fatiamento. Se a tira de tecido se desprender do bloco de agarose, tente incorporar o tecido em uma concentração mais alta de agarose. Se as fatias do tumor forem mais grossas do que o desejado (conjunto da máquina) ou forem assimétricas, aumente a amplitude e diminua a velocidade da lâmina do vibrato. Para garantir que o tecido tumoral não fique preso ou "arrastado" pelo porta-lâminas, à medida que ocorre o corte, posicione cuidadosamente a microespátula entre o porta-lâminas e a fatia, à medida que a lâmina se move.
- Transfira as fatias de tecido para a placa de Petri com meio de processamento gelado usando uma microespátula de aço inoxidável.
- Obtenha placas de 6 poços contendo insertos de PTFE e meios de cultura de fatias equilibradas da incubadora (conforme preparado na seção 2, etapa 4).
- Aplique fatias de tecido usando uma microespátula de aço inoxidável. Minimize o contato direto e a manipulação do tecido usando um pincel de cerdas finas pequenas para gerar uma "onda fluida" para empurrar suavemente a fatia para fora da espátula e para o inserto de cultura.
nota: Minimize a quantidade de meio de processamento introduzido na parte superior do inserto de cultura de tecidos. Se quantidades excessivas de mídia forem transferidas, fazendo com que as fatias flutuem, use uma pipeta Pasteur estéril para remover a mídia.
- Retorne as placas de 6 poços contendo fatias tumorais para uma incubadora mantida a 37 °C com uma atmosfera de CO2 a 5%.
nota: Todo o protocolo de incorporação e fatiamento deve ser concluído dentro de 90 minutos após a aquisição do tecido tumoral da sala de cirurgia.
4. Manutenção da cultura de fatias
- Após 12 - 24 h, transfira as culturas de fatias segurando cada borda de inserção com uma pinça estéril e transfira para placas contendo meios de manutenção de culturas de fatias frescas. Certifique-se de que o meio de manutenção da cultura de fatias aliquotado em cada poço esteja equilibrado na incubadora por pelo menos 15 minutos antes de transferir as pastilhas.
- Mova as pastilhas para novas placas de 6 poços com meios de cultura de fatias balanceadas a cada 48 h.
- Se desejar, alíquota de meios de cultura de fatias antigas com uma pipeta para uso imediato em ensaios bioquímicos ou congelar a -80 °C para uso futuro.
