Desenvolvendo um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica humana

Resumo

Fonte: Fattakhov, N., et al. Um modelo triplo de cultura de células primárias da barreira hematoencefálica humana para estudar o AVC isquêmico in vitro. (2022)

Este vídeo demonstra a co-cultura de células pericitos, astrócitos e endoteliais do cérebro humano. Cada camada celular é formada separadamente e depois cultivada em conjunto, criando um sistema de três camadas que imita o arranjo celular da barreira hematoencefálica

Protocolo

1. Configuração do modelo BBB de cultura de células triplas

1. Semeando pericitos
   1. Cultivar HBVP (pericitos vasculares do cérebro humano) em frascos de cultura T75 com uma superfície ativada para adesão celular dentro de uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C até ficar confluente. Uma vez alcançada a confluência, aspire o meio pericitário antigo e lave as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco quente (DPBS). Aspire a DPBS e retire as células do frasco usando uma combinação de 4 mL de solução quente de tripsina-EDTA e 1 mL de DPBS.
      NOTA: Evite usar passagens posteriores a P7.
   2. Incubar o balão durante 5 minutos a 37 °C numa incubadora de CO₂. Ver ao microscópio para confirmar se as células estão separadas do frasco. Adicione 5 mL de meio pericitário quente (contendo 2% de soro fetal bovino [FBS]) ao frasco e transfira as células destacadas para um tubo de centrífuga de 50 mL.
   3. Centrifugue a suspensão celular por 3 min a 200 × g, permitindo que as células formem um pellet no fundo do tubo. Aspire o meio do tubo, garantindo que o pellet celular permaneça intacto.
   4. Ressuspender o sedimento celular em meio pericito; calcular a quantidade de meio em função da confluência das células e do número de inserções de poços necessárias. Pegue 10 μL das células ressuspensas, coloque-as em uma lâmina de contagem de células e conte o número de células.
   5. Determine a densidade celular e semeie 300.000 células/inserção em 1 mL de meio pericito no lado abluminal das inserções de poços (formato de 6 poços).
      nota: Ao semear HBVP na parte inferior das pastilhas, é importante virar as placas bem inseridas de cabeça para baixo. Enquanto a placa é colocada plana sobre uma superfície, remova a seção inferior para expor o lado abluminal das inserções do poço. Cubra as inserções de poço com a placa invertida após adicionar a suspensão de células de pericito no lado abluminal para evitar a evaporação. Mantenha todas as placas viradas de cabeça para baixo em uma incubadora de CO_{5% 2} a 37 ° C durante a noite.
2. Semeando astrócitos
   1. Cultivar AH (astrócitos humanos) em frascos T75 numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C até atingir a confluência. Siga as etapas acima 1.1.1-1.1.4 usando meio de astrócitos (também contendo 2% de FBS) em vez de meio pericito.
      NOTA: Evite usar passagens posteriores a P9.
   2. Determine a densidade celular e semeie 300.000 células/poço no fundo das placas de 6 poços de cultura de tecidos. Cubra a placa para evitar a evaporação e mantenha todas as placas em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C durante a noite.
3. Semeando células endoteliais
   1. Cultive HBMEC (células endoteliais microvasculares do cérebro humano) em placas de cultura de tecidos dentro de uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C até ficar confluente. Siga as etapas acima 1.1.1-1.1.4 usando um meio clássico completo (contendo 10% de FBS) em vez de um meio pericito.
      nota: Evite usar passagens posteriores a P12.
   2. Retirar as placas de 6 poços de cultura de tecidos contendo astrócitos e os percitos (formato de 6 poços) contendo pericitos da incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C. Aspirar o meio de astrócitos das placas de 6 poços de cultura de tecidos. Adicione 1 mL de meio pericyte e 1 mL de meio astrócito a cada poço.
   3. Aspire o meio pericito das inserções do poço e coloque-o nas placas de 6 poços de cultura de tecidos contendo os astrócitos semeados. Semear HBMEC a uma densidade de 300.000 células/poço em 2 mL do meio clássico completo no lado apical das mesmas inserções de poço.
      nota: As células endoteliais devem ser semeadas no lado apical das inserções de poços no dia seguinte após a semeadura de pericitos no lado abluminal das inserções de poços e astrócitos em placas de 6 poços de cultura de tecidos. As células devem ser mantidas em cultura tripla por seis dias para induzir propriedades semelhantes à BHE. O meio de cultura celular deve ser trocado em ambos os compartimentos de inserção 24 horas antes dos experimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Transwell de 24 mm com inserção de membrana de poliéster de poros de 0,4 μm	Corning	3450
Pratos com fundo de vidro de 35 mm	MatTek Ciências da Vida (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Meio Astrócito	Célula de Ciência	1801
Fator de Apego	Sistemas Celulares (Fisher Scientific)	4Z0-201
Complete Classic Medium com Sérum e CultureBoost	4Z0-500	Sistemas Celulares
Tubos de centrífuga Corning 50 mL PP (fundo cônico com tampa CentriStar	VWR	430829
Corning 75cm² em forma de U pescoço inclinado não tratado frasco de cultura de células	Corning	Rolamento 431464U
Microplacas de Poliestireno Preto de Fundo Transparente Plano de 96 poços Corning CellBIND	Corning	3340
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countes	Thermo Fisher Científico	C10228
Contador de Células Automatizado Countess II FL	Thermo Fisher Científico	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Meio DMEM (sem glicose, sem glutamina, sem vermelho de fenol)	ThermoFisher	A14430-01	Meio sem glicose
DPBS (sem cálcio, sem magnésio)	ThermoFisher	14190250
EBM Crescimento de Células Endoteliais Meio Basal, Sem Vermelho de Fenol, 500 mL	Lonza	CC-3129
Incubadora de CO2
centrifuga