Um método para bioimpressão 3D de astrócitos corticais murinos

Resumo

Fonte: de Melo, B. A. G., et al., Bioimpressão 3D de astrócitos corticais murinos para engenharia de tecido semelhante a neurais. J. Vis. Exp. (2021)

O vídeo demonstra o processo de criação de uma construção bioimpressa em 3D usando astrócitos suspensos em uma solução de bioink. A construção bioimpressa, após a reticulação, facilita a adesão dos astrócitos e sua disseminação, formando tecido semelhante a neurais.

Protocolo

1. Síntese de gelatina metacriloil (GelMA)

1. Pesar 10 g de gelatina obtida de pele de suíno e dissolver em 100 ml de PBS, deixando a solução agitar numa placa de aquecimento a 240 rpm e a 50 °C até à sua completa dissolução.
2. Sob uma capa, adicione 2 mL de anidrido metacrílico (MA) para um baixo grau de funcionalização e deixe a emulsão de gelatina mexer a 240 rpm e 50 °C por 2 h.
   cuidado: Declaração de perigo MA: H302 + H332 (nocivo por ingestão), H311 (tóxico em contacto com a pele), 314 (provoca queimaduras graves na pele e lesões oculares), 315 (provoca irritação cutânea), H317 (pode causar uma reação alérgica cutânea), H318 (provoca lesões oculares graves), 331 (tóxico por inalação), H332 (nocivo por inalação), H335 (pode causar irritação respiratória). Diretrizes de manuseio: P261 (evitar respirar poeira/fumaça/gás/névoa/vapores/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: Enxágue cuidadosamente com água por vários minutos. Remova as lentes de contato, se presentes e fáceis de fazer. Continue enxaguando. Ligue imediatamente para um CENTRO DE VENENOS/médico), P301 + P312 + P330 (SE FOR INESPERADO: Ligue para um CENTRO DE VENENOS/médico se não se sentir bem. Enxágue a boca).
   nota: Adicione MA muito lentamente, gota a gota.
3. Diluir a solução de gelatina-MA em 100 mL de PBS pré-aquecido (50 °C) para obter 200 mL de volume final e deixar a solução agitar a 240 rpm e 50 °C por 10 min.
4. Corte ~ 20 cm da membrana de diálise (corte molecular 12-14 kDa) e mergulhe-a em água deionizada até que esteja macia.
   nota: Encha as membranas com água deionizada para garantir que não haja furos ou defeitos.
5. Usando um funil, transfira a solução de gelatina-MA para as membranas.
   nota: Feche os dois lados, deixando espaço extra no interior para permitir a mistura.
6. Colocar as membranas contendo a solução de gelatina-MA em um recipiente com 2 L de água destilada para diálise e deixar mexer a 40 °C por 5 dias (500 rpm).
   nota: Cubra o recipiente para evitar a evaporação da água.
7. Troque a água destilada duas vezes ao dia. A cada vez, vire as membranas de cabeça para baixo para homogeneização.
8. No quinto dia, misture 200 mL de água ultrapura pré-aquecida (40 °C) com a gelatina dialisada-MA e mexa por 15 min a 40 °C.
9. Transferir a solução de gelatina-MA para tubos cônicos de 50 mL até 25 mL e deixar os tubos permanecerem a -80 °C por 2 dias.
   nota: Armazene os tubos horizontalmente para facilitar a liofilização.
10. Liofilize as soluções congeladas por 3-5 dias e armazene o GelMA liofilizado protegido da umidade.

2. Preparação de biotinta

NOTA: Para obter 1 mL de bioink, recomenda-se fabricar pelo menos 3 mL de solução de biomaterial, pois pode haver perdas durante a filtração.

1. Preparação da solução de fibrinogênio
   1. Preparar solução salina (NaCl 0,9%) em água deionizada e dissolver 10 mg de fibrinogênio do plasma bovino em 1 mL da solução salina para obter uma concentração de 10 mg/mL.
      nota: Como o fibrinogênio adsorve no vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução de fibrinogênio.
   2. Deixar a solução sob agitação a 37 °C até à dissolução completa do fibrinogénio.
      NOTA: Para dissolução do fibrinogênio, use um sistema rotativo colocado dentro de um forno a 37 ° C. A agitação magnética (180 rpm) do fibrinogênio em uma placa quente a 37 ° C também é adequada. Nessa condição, o fibrinogênio 10 mg/mL leva aproximadamente 40 minutos para se dissolver.
2. Preparação de gelatina/solução de GelMA
   1. Pesar 0,12 g de gelatina e adicioná-lo a 1,9 mL de PBS pré-aquecido (40 °C) para obter uma concentração final de 4% (p/v) de gelatina. Vórtice para facilitar a dissolução.
   2. Manter a emulsão a 40 °C até à dissolução completa.
   3. Pese 0,06 g de GelMA liofilizado e transfira para a solução de gelatina para obter uma concentração final de 2% (p/v) de GelMA. Vórtice para facilitar a dissolução.
   4. Manter a solução a 40 °C até à dissolução completa.

3. Preparação de gelatina carregada de astrócitos/GelMA/bioink de fibrinogênio

1. Pipete 0,9 mL da solução de fibrinogênio de 10 mg / mL e transfira para a solução de gelatina / GelMA para obter uma concentração final de 3 mg / mL de fibrinogênio.
2. Pesar 0,015 g de fotoiniciador (PI) e transferir para a solução de gelatina/GelMA/fibrinogênio para obter uma concentração final de 0,5% (p/v) de PI. Misture a solução virando o tubo para cima e para baixo e mantenha-o a 40 ° C protegido da luz para evitar a degradação do PI.
   nota: Armazene a bioink a 4 °C por no máximo 24 h.
3. Sob o fluxo laminar, filtre a solução usando um filtro de 0,2 μm em um tubo cônico estéril de 15 mL.
   nota: A solução de biomaterial deve estar a 37-40 °C para permitir a filtração.
4. Transferir 980 μL da solução de biomaterial para um tubo cónico de 15 ml.
5. Diluir a laminina em solução salina para obter uma solução-mãe de 100 μg/ml.
6. Pipetar 20 μL de laminina e transferir para o tubo que contém a biotinta para obter uma concentração final de 2 μg/ml de laminina.
7. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo, evitando bolhas. Se persistirem bolhas, centrifugue o tubo cónico a 200 x g durante 2 min. Manter a biotinta a 37 °C até que esteja misturada com as células.
8. Tripsinizar astrócitos primários com 0,05% de tripsina por 5 min.
   nota: Use astrócitos das passagens 1 a 3.
9. Neutralize a atividade da tripsina com FBS na proporção de 1:1 e transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
10. Conte as células e transfira 1 x 106 células para um tubo cônico diferente. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
11. Remova o sobrenadante deixando um pequeno volume (~ 200 μL) para suspender o pellet celular, batendo suavemente na parte inferior do tubo cônico.
12. Transfira 1 mL de solução de gelatina/GelMA/fibrinogênio para o tubo que contém as células e pipete suavemente para cima e para baixo para homogeneizar, obtendo uma concentração final de 1 x 10⁶ células/mL.

3. Preparação da solução de reticulador

1. Reconstituição da trombina
   1. Prepare uma solução estoque de trombina 100 U / mL em água deionizada estéril com albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% (p / v) em um tubo cônico de 15 mL. Estoque em microtubos a -20 °C.
      NOTA: Como a trombina é adsorvida no vidro, não use frascos de vidro para preparar a solução de estoque ou armazenar as alíquotas.
2. Preparação da solução de trombina-CaCl₂
   1. Pipete 100 μL de solução estoque de trombina e transfira para um tubo cônico de 50 mL contendo 8,9 mL de água deionizada estéril para obter uma concentração final de 1 U / mL de trombina.
   2. Prepare uma solução de CaCl₂ a 10% (p/v) em água deionizada e esterilize usando um filtro de 0,2 μm.
   3. Transferir 1,1 mL da solução de CaCl₂ a 10% para o tubo cônico contendo trombina, a fim de obter uma proporção final de 1:9 (CaCl₂ para trombina).
      nota: Preparar a solução de reticulador no volume da experiência, evitando o armazenamento.

4. Bioimpressão de biotinta carregada de astrócitos usando uma bioimpressora baseada em extrusão

1. Desenho do tecido neural
   1. Usando o código G: construa uma grade de 6 x 6 mm (forma quadrada) com 1 mm de distância entre cada linha bioimpressa nos eixos X e Y e 6 camadas no eixo Z (0,2 mm entre cada linha); defina a extrusão (E) para 0,01 mm, aumentando 0,001 mm a cada nova camada do eixo Z; e defina a velocidade de impressão (F) para 400 mm/min (Informações Suplementares).
2. Configuração da bioimpressora
   1. Exponha a máquina à luz ultravioleta por 15 min e, em seguida, limpe-a com etanol 70%.
   2. Ligue a bioimpressora usando o botão liga/desliga. Conecte a máquina ao computador por meio de um cabo USB. Abra o software de controle para conectá-lo à bioimpressora e carregue o design do arquivo.
3. Preparação da seringa de bioimpressão
   1. Transfira a gelatina carregada de astrócitos/GelMA/bioink de fibrinogênio para uma seringa plástica de 5 mL usando uma pipeta de 1.000 μL.
      nota: Transfira lentamente para evitar a formação de bolhas.
   2. Conecte uma agulha romba estéril de 22 G à seringa.
      nota: Deixe a seringa a 4 °C durante 2 min.
   3. Conecte a seringa ao cabeçote de impressão da bioimpressora e lave manualmente a biotinta para remover as bolhas restantes.
4. Bioimpressão
   NOTA: A bioimpressão foi realizada fora da capela laminar.
   1. Coloque uma placa de cultura de 35 mm na mesa da bioimpressora e posicione a agulha a 0,1 mm de distância da superfície da placa de cultura para permitir o movimento da agulha.
      NOTA: Use uma placa de cultura de 35 mm para cada bioimpressão.
   2. Pressione o botão Imprimir.
   3. Quando a bioimpressão terminar, certifique-se de que a seringa se afaste do prato. Em seguida, feche a placa de cultura e prepare-se para o processo de reticulação.
      nota: A bioimpressão de uma construção leva aproximadamente 1 min e 10 s.
5. Reticulação da construção bioimpressa e da cultura
   1. Coloque a placa de cultura sob luz ultravioleta a 2 mW/cm2 por 2 x 60 s (para cima e para baixo) para reticulação GelMA.
   2. Sob o fluxo laminar, transfira a construção bioimpressa para uma placa de 24 poços usando uma espátula estéril.
   3. Adicione 500 μL de solução de trombina/CaCl₂ e deixe por 30 min para permitir a reticulação da fibrina.
   4. Remova a solução de reticulação e lave a construção com 2 mL de PBS 1x. Em seguida, substitua o PBS por 1 mL de meio de cultura de astrócitos e incube a 37 °C e 5% de CO₂. Troque o meio a cada 3 dias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioimpressora 3D	Soluções de biotecnologia 3D		Bioimpressora baseada em extrusão
Pinça de ponta romba	Integra Miltex	6--30	Fórceps para dissecção cerebral previamente esterilizada
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Sem protease, sem ácidos graxos, essencialmente sem globulina
CaCl2	Sigma-Aldrich	Rolamento 10043-52-4
Balão de cultura celular	Fisher Científico	Rolamento 156340	Balão de cultura T25
DAPI	Abcam	AB224589	Solução de coloração DAPI
DMEM/F12	Gibco; Corporação de Tecnologias da Vida	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Mod. De Eagle's Medium / Ham's F12 50/50 Mix) com L-glutamina
Tubos de diálise	Sigma-Aldrich	D9527	Corte de peso molecular = 14 kDa
etanol	Fisher Científico	64-15-5	Grau de reagente
Soro fetal bovino	Gibco; Corporação de Tecnologias da Vida	12657011	Grau de pesquisa
fibrinogênio	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogênio cristalino em pó de plasma bovino
gelatina	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatina em pó de pele suína
Solução salina tamponada Hanks (HBSS)	Gibco; Corporação de Tecnologias da Vida	14175095	Sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol
Laminina	Sigma-Aldrich	Rolamento 114956-81-9	Laminina 1-2 mg/mL L em Tris-HCl 50 mM
Anidrido metacrílico	Sigma-Aldrich	760-93-0	Para preparação de GelMA
Agulha 22G	Fisher Científico	NC1362045	Agulha romba estéril
Placa de Petri	Corning Incorporada	430591, 430588	Placas de Petri estéreis de 35 e 100 mm
Fotoiniciador	Sigma-Aldrich	Rolamento 106797-53-9	2-Hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona
Tampão fosfato salino (PBS)	Gibco; Corporação de Tecnologias da Vida	10010023	PBS 1 x, grau de cultura, sem cálcio, sem magnésio
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	Rolamento 25988-63-0	Bromidrato de poli-L-lisina mol peso 30.000-70.000
Seringa 5 mL	Bd	1222C84	Seringa estéril
Filtro de seringa 2 μm	Fisher Científico	09-740-105	Filtro de polipropileno para esterilização
Trombina	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Trombina cristalina em pó de plasma bovino
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Grau laboratorial
Tripsina-EDTA	Gibco; Corporação de Tecnologias da Vida	15400054	Tripsina sem vermelho de fenol 1 x diluído em PBS
Placa de poço	Thermo Científico	Rolamento 144530	Placa estéril de 24 poços