Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Tiolação do ácido hialurônico
NOTA: As razões molares são indicadas em relação a um número total de grupos carboxilatos, a menos que especificado de outra forma.
- Dissolva 500 mg de hialuronato de sódio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg / mL em água destilada deionizada (DiH2O) em um frasco Erlenmeyer esterilizado em autoclave de 250 mL. Agite a solução (~ 200 rpm) em temperatura ambiente por 2 horas para dissolver completamente o HA. Use uma barra de agitação e uma placa de agitação magnética para manter a reação agitada durante o procedimento de tiolação.
- Usando ácido clorídrico (HCl) 0,1 M, ajuste o pH da solução de HA para 5,5. Pesar 69,6 mg (razão molar de 0,25x) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).
nota: Embora o EDC não dissolvido possa ser adicionado diretamente à solução de HA, normalmente é mais fácil dissolver o EDC primeiro em 1 mL de DiH2O e, em seguida, adicionar rapidamente a solução de EDC à solução de HA. A pré-dissolução em 1 mL de DiH2O também pode ser feita com N-hidroxisuccinimida (NHS) e cistamina diidroclorida antes de adicionar à reação nas etapas 1.3 e 1.4.
- Adicione 17,9 mg (razão molar de 0,125x) de NHS à reação. Ajustar o pH da solução de reacção para 5,5 utilizando HCl 0,1 M e incubar a reacção à temperatura ambiente durante 45 minutos.
- Adicione 70,0 mg (razão molar de 0,25x) de dicloridrato de cistamina na solução de reação. Use hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 M para ajustar o pH para 6,25. Incube a reação em temperatura ambiente durante a noite, mexendo.
- No dia seguinte, utilizar NaOH 1 M para ajustar o pH da solução de reacção para cerca de 8. Adicione 192 mg (proporção molar de 4x) de ditiotreitol (DTT) à reação. Ajuste o pH de volta para 8 após a adição de DTT e deixe mexer por 1-2 horas em temperatura ambiente.
- Use 1 M HCl para ajustar o pH para 4. Transfira toda a mistura de reação para uma membrana de diálise pré-embebida (corte de peso molecular em torno de 13 kDa) e dialise contra DiH2O pré-ajustado para pH 4,
nota: O volume de DiH2O para diálise deve ser pelo menos 40 vezes o volume da solução de AH reagida (por exemplo,., 50 mL de amostra em 2 L de DiH2O, pH 4).
- Substitua a solução de diálise (DiH2O, pH 4) duas vezes ao dia por 3 dias em temperatura ambiente.
- Filtre a solução dialisada através de uma membrana de 0,22 μm, filtro acionado por vácuo. Solução de congelamento rápido de AH tiolado em nitrogênio líquido. Use um liofilizador para congelar amostras secas ao longo de 2 dias. O HA tiolado na forma seca pode ser armazenado em um dessecador selado a vácuo a -20 °C por pelo menos 6 meses.
- Para determinar o grau de tiolação, use o teste de Ellman e/ou espectroscopia de RMN de prótons.
2. Preparação de materiais de reticulação
- Dissolva o HA tiolado na concentração desejada (neste exemplo, 13,3 mg/mL) em solução salina tamponada com HEPES (HEPES 20 mM no tampão salina balanceado de Hank (HBSS), ajustado para cair dentro de um pH de 8-9) em um frasco âmbar para minimizar a exposição à luz ambiente. Mantenha a solução mexendo constantemente.
nota: A formação de ligações dissulfeto entre tióis conjugados ao AH pode ocorrer se o pH estiver acima de 8, a concentração da solução for muito alta ou a solução for deixada mexendo por muito tempo antes da gelificação. Para evitar esse problema, use menos de 15 mg/mL de HA tiolado e dissolva o HA tiolado dentro de 2 horas após a formação dos hidrogéis.
- Dissolver maleimida de 4 braços de PEG (PEG-Mal, 20 kDa) e 4 braços-PEG-tiol (PEG-tiol, 20 kDa) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, para preparar soluções estoque de 50 mg/mL de PEG-Mal e PEG-tiol.
nota: Demora pelo menos 1 hora para dissolver completamente os reagentes PEG.
- Se adicionar peptídeos derivados de MEC, dissolva os peptídeos contendo cisteína em PBS para preparar uma solução estoque.
nota: Use uma concentração de estoque de 2-4 mM.
- Mergulhe os moldes de borracha de silicone em etanol por pelo menos 20 minutos para limpá-los e depois autoclave-os para esterilização.
3. Reticulação de hidrogel e encapsulamento celular
NOTA: Como exemplo aqui, é descrito o encapsulamento de quatro hidrogéis individuais de 80 μL com HA a 0,5% (p/v) e módulo de compressão de 1 kPa3. Consulte a Tabela 1, por exemplo, receitas que produzem hidrogéis com propriedades variadas: dois hidrogéis incorporando o peptídeo de ligação à integrina RGD e dois hidrogéis incorporando tampas de cisteína como controle negativo da atividade peptídica. A concentração de semeadura de células GBM derivadas do paciente é de 500.000 células/mL.
- Diluir a solução-mãe de PEG-Mal (50 mg/ml, do passo 2.2) para 12,5 mg/ml adicionando 40 μl da solução-mãe a 120 μL de PBS. Divida a solução diluída em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, cada um com 80 μL.
- Adicione 16 μL de solução RGD estoque (2,8 mM, da etapa 2.3) a um tubo e 16 μL de solução estoque de cisteína (2,8 mM, da etapa 2.3) ao segundo tubo. Vórtice para misturar. Coloque as soluções PEG-Mal-RGD ou PEG-Mal-CYS no gelo até o uso na etapa 3.9.
nota: O procedimento descrito aqui produz hidrogéis com ~ 140 μM de peptídeo. Isso equivale a aproximadamente 1 em cada 8 braços PEG disponíveis ocupados com um peptídeo. Isso pode ser variado alterando a razão molar de peptídeos terminados em cisteína para grupos maleimida disponíveis. Em geral, uma concentração máxima de 280 μM de peptídeo pode ser alcançada, deixando um número suficiente de grupos maleimida disponíveis para reticulação de hidrogel.
- Diluir a solução-mãe de PEG-tiol (50 mg/ml, do passo 2.2) para 5 mg/ml misturando 4 μL de solução-mãe de 50 mg/ml com 36 μL de PBS. Adicione 120 μL de HA tiolado dissolvido da etapa 2.1 à mistura.
nota: As soluções de HMW HA são muito viscosas. Assim, recomendamos o uso de uma ponta de micropipeta de orifício largo para transferir soluções. Pipete lentamente para evitar que a solução grude nas paredes da ponta da micropipeta e para melhorar a precisão da medição.
- Coloque os moldes limpos e secos (preparados na etapa 2.4) em cada poço de uma placa de 12 poços não tratada com cultura de tecidos. Usando a extremidade limpa e romba de uma ponta de pipeta, pressione o molde de gel e verifique novamente a vedação entre os moldes e o fundo da placa do poço.
nota: Verifique a vedação novamente antes do encapsulamento para evitar vazamentos.
- Células GBM cultivadas em passagem, dissociam-se em células únicas e determinam a concentração celular conforme descrito anteriormente3.
nota: Algumas linhas de GBM não podem ser dissociadas em células únicas. Nesse caso, gliomasferas inteiras podem ser encapsuladas. No entanto, prepare células individuais dissociadas após a contagem precisa de células para melhorar a reprodutibilidade. O protocolo para passagem da gliomasfera varia entre os diferentes laboratórios e muitos deles são provavelmente compatíveis com o encapsulamento de hidrogel.
- (Recomendado) Centrifugue gliomaspheres a 500 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de enzima de dissociação celular ao pellet celular. Em seguida, incube por 5 min, batendo suavemente no tubo para agitar.
- Adicione 4 mL de meio de cultura completo (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 μg/mL de heparina, suplemento G21 e penicilina/estreptomicina a 1% em DMEM/F12) às células.
- Centrifugue novamente a 500 x g por 5 min e remova o sobrenadante. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em 1 mL do meio completo e passe as células suspensas por um filtro de células de 70 μm. (Recomendado) lave o filtro com mais 4 mL do meio completo para maximizar o número de células recuperadas.
- Estime a concentração de células na suspensão usando um hemocitômetro. Divida a suspensão celular em 2 tubos de centrífuga, onde cada tubo contém ~ 80.000 células. Centrifugue a 500 x g por 5 min; geralmente, 80.000 células compõem 2 hidrogéis de 80 μL.
- Remover o sobrenadante e ressuspender um sedimento em 80 μl de solução de PEG-MAL-RGD e um segundo sedimento em 80 μl de solução de PEG-MAL-CYS (preparado no passo 3.1).
- Usando uma ponta de micropipeta de orifício largo de 200 μL, dispense 40 μL de solução de HA (da etapa 3.3 acima) em cada molde de silicone de borracha (conforme preparado na etapa 3.4).
- Usando uma ponta de micropipeta de orifício largo de 200 μL, misture os 40 μL de solução de células PEG-MAL-CYS ou PEG-MAL-RGD com a solução de HA no molde. Pipete para cima e para baixo rapidamente não mais do que 10 vezes. Repita para cada cultura de gel que está sendo preparada.
nota: Esta etapa requer prática, pois a gelificação inicial ocorre rapidamente (dentro de 30 s). Pipete para cima e para baixo enquanto move a ponta para diferentes locais nos moldes para garantir uma mistura uniforme. Mantenha sempre a ponta abaixo do nível do líquido para evitar a formação de bolhas de ar. Não misture a solução muitas vezes, pois o gel pode se formar dentro da ponta da micropipeta. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD podem ser combinados em proporções variadas para atingir a concentração desejada do peptídeo RGD.
- Colocar a placa de pulverização contendo células encapsuladas em gel numa incubadora de cultura de células a 37 °C durante 5 a 10 minutos para garantir a conclusão da reacção.
- Adicione 2-2,5 mL de meio de cultura a cada poço com géis formados. Use uma ponta de pipeta estéril de 2 μL ou microespátula para separar suavemente o molde e o gel. Use uma pinça pré-esterilizada para remover o molde da placa do poço. Coloque a placa do poço de volta na incubadora de células (37 °C e 5%CO2) para cultura e experimentos futuros.
nota: Puxe o molde verticalmente para cima para evitar danificar as culturas de gel. Em geral, o meio nas culturas de gel deve ser substituído a cada 3-4 dias. Tome cuidado para não aspirar hidrogéis ao remover o meio. Se isso for um problema, recomendamos o uso de uma pipeta de transferência de plástico. Se a imagem de bioluminescência para rastrear o número de células for planejada, as células GBM devem ser transduzidas com lentivírus codificando constitutivamente a expressão de luciferase antes do encapsulamento, conforme descrito anteriormente3. Para imagens de bioluminescência, adicione 1 mM de D-luciferina ao meio de cultura 1 h antes da imagem de luminescência.
