Analisando a sobrevivência das células de Purkinje em culturas de fatias cerebelares organotípicas

Resumo

Fonte: Rakotomamonjy, J., et al. Sobrevivência de células de Purkinje em culturas de fatias cerebelares organotípicas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo ilustra uma técnica para obter fatias organotípicas cerebelares do cérebro de um filhote de camundongo e cultivar as fatias em meio suplementado com nutrientes e fatores de crescimento para imitar o desenvolvimento cerebelar in vitro. Além disso, fatias cerebelares específicas são tratadas com um composto de teste e a capacidade neuroprotetora do composto é analisada usando uma técnica de coloração por imunofluorescência.

Protocolo

1. Preparação antes das culturas de fatias cerebelares organotípicas

1. Em uma capa de cultura de células pulverizada com etanol a 70% previamente, prepare 200 mL de meio de cultura em um filtro de vácuo de 250 mL conectado a um receptor de frasco estéril. Adicione 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL de soro de cavalo inativado pelo calor, 1 mL de 200 mM de L-Glutamina (concentração final de 1 mM) e 5 mL de glicose de 200 g/L (concentração final de 5 mg/mL). Filtre o meio de cultura a vácuo e mantenha-o a +4 °C por até um mês.
2. No armário de biossegurança esterilizado, retire uma placa de cultura de 6 poços da embalagem. Encha cada poço com 1 mL de meio de cultura. Se um tratamento for testado, adicione o agente farmacológico ao poço tratado e o mesmo volume de solução veicular para o poço de controle. No presente estudo, adicionamos 1 μL de solução estéril de KCl 3 M ao poço tratado (30 mM final) e 1 μL de água estéril aos poços controle.
3. Traga para dentro da capa de cultura de células o número necessário de insertos de cultura de células embalados individualmente com membrana de politetrafluoretileno hidrofílico (PTFE) (tamanho dos poros = 0,4 μm). Desembrulhe-os cuidadosamente e retire as inserções de cultura de células com uma pinça estéril. Solte-os um a um em um poço de uma placa de 6 poços, evitando bolhas na interface entre a membrana de inserção e o meio de cultura de células. Deixe as pastilhas se equilibrarem no meio em uma incubadora de CO₂ a 37 °C, 5% por pelo menos 2 h antes da cultura.
   nota: O picador de tecidos reside permanentemente na capa de cultura de células.
4. Prepare dois copos de 200 mL, um cheio de 150 mL de água estéril e o outro cheio de 150 mL de etanol a 70%. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas no banho de etanol a 70% e depois em água antes de usá-las.
   nota: Não use ferramentas cirúrgicas imediatamente após o contato com etanol.
5. Desinfetar a lâmina de dois gumes no copo de etanol a 70%. Coloque-o no porta-lâminas usando uma pinça estéril e segure-o no lugar usando a chave de fixação da lâmina. Deixe secar até usar.
6. Desinfetar o disco de plástico fornecido com o picador de lenços de papel no copo de etanol a 70%. Pulverize a mesa de corte com etanol a 70% antes de colocar o disco sobre ela. Deixe secar até usar.

2. Dissecção e culturas de fatias organotípicas cerebelares

1. Traga o filhote de camundongo para dentro do capuz de cultura de células para realizar a dissecação.
2. Decapite o filhote rapidamente usando uma tesoura reta (Figura 1A).
3. Enquanto segura a cabeça do filhote pelo nariz com uma pinça de curativo reta, corte o couro cabeludo usando uma tesoura reta, começando pela extremidade posterior e indo de lateral para a linha média.
4. Proceda de forma idêntica para o crânio.
   nota: Certifique-se de apontar as pontas da tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo durante a dissecção.
5. Retire o cérebro e transfira-o para um prato de 60 mm cheio de HBSS frio + 5 mg / mL de glicose.
6. Disseque cuidadosamente o cerebelo usando uma pinça fina reta estéril (Figura 1B). Transfira-o para o disco de plástico colocado na mesa de corte do picador de tecidos usando uma pinça fina curva estéril.
7. Oriente o tecido girando a mesa de corte para realizar cortes parassagitais.
8. Mova a mesa de corte puxando o botão de liberação da mesa para a direita, de modo que a lâmina fique posicionada na borda do tecido.
9. Ajuste a espessura da fatia para 350 μm e a velocidade da lâmina para média.
10. Ligue o helicóptero. Depois que todo o cerebelo tiver sido cortado (Figura 1C), desligue o picador.
11. Remova o disco de plástico com uma pinça estéril.
12. Aproxime cuidadosamente o disco de plástico de uma placa de 60 mm contendo HBSS + 5 mg/mL de glicose. Pipete HBSS frio + 5 mg/mL de glicose no tecido usando uma pipeta de transferência estéril para permitir a colheita de fatias cerebelares no prato cheio de tampão.
13. Separe as fatias cerebelares umas das outras usando uma microssonda. Retire cortes de boa qualidade com a pipeta de transferência (recomenda-se usar cortes de tecido próximos ao vermis) e coloque-os em um inserto de cultura de células pré-equilibrado (Figura 1D).
14. Posicione as fatias cerebelares no inserto de cultura de células usando a microssonda e, em seguida, remova cuidadosamente o excesso de HBSS + 5 mg/mL de solução de glicose com a pipeta de transferência.
    nota: Nesta fase, o tecido é extremamente sensível e propenso a danos físicos. O número máximo de fatias cerebelares por inserção de cultura de células depende da idade do animal doador. 6 a 8 fatias podem ser cultivadas para um animal com idade P0 a P4 e 4 a 6 fatias para animais com mais de P5.
15. Coloque a placa de cultura na incubadora, trocando completamente o meio a cada 2–3 dias.
16. Para avaliar a sobrevivência das células de Purkinje, as fatias podem ser coletadas em até 5 dias in vitro. Para outros fins, eles podem ser mantidos em cultura por várias semanas (Figura 1F).
    nota: No caso de experimentos de sobrevivência de células de Purkinje, não há necessidade de renovar o tratamento farmacológico ao mudar o meio de cultura celular (Figura 1F).

3. Imunofluorescência

1. Retire a placa de 6 poços da incubadora. Remova o meio de cultura de células, lave o inserto de cultura de células com 1x PBS e fixe as fatias com solução fria de paraformaldeído a 4% por 1 h, com 1 mL sob o inserto de cultura de células e 500 μL em cima do inserto de cultura de células.
2. Lave os insertos 4x 10 min com 1x PBS, com 1 mL abaixo e 500 μL em cima do inserto, em um agitador orbital.
3. Com um pincel, transfira as fatias cerebelares de 1 inserção de cultura de células para 1 poço de um poço de 24 poços pré-preenchido com 1x PBS, 0,25% Triton X-100 e 3% BSA (PBS-TB), 500 μL / poço.
4. Permeabilize e bloqueie as fatias por incubação em PBS-TB por 1 h em temperatura ambiente.
5. Incubar com anticorpos primários diluídos na solução de PBS-TB, durante a noite a + 4 °C, num agitador orbital, 200 μL/alvéolo.
6. No dia seguinte, realizar quatro lavagens de 10 min com 1x PBS, em agitador orbital, 500 μL/poço.
7. Incubar com anticorpos secundários diluídos na solução de PBS-TB, duas horas em temperatura ambiente, em agitador orbital, e protegido da luz, 200 μL/poço.
8. Realizar quatro lavagens de 10 min com 1x PBS, em agitador orbital, 500 μL/poço.
9. Contra-corar as fatias com Hoechst 33342, diluído em 1x PBS (2 μg/mL), por 10 min à temperatura ambiente, protegido da luz, 500 μL/poço.
10. Monte as fatias cerebelares em uma lâmina de microscopia com uma pipeta de transferência. Deixe-os secar completamente ao ar, protegidos da luz. Umidifice-os novamente com 1x PBS e aplique uma lamínula coberta com algumas gotas de meio de montagem (~ 80 μL). Evite fazer bolhas.
11. Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem fotografadas.

4. Imagem e quantificação da sobrevivência celular

1. Ligue o microscópio e os lasers de acordo com o fabricante.
2. Inicie o software de aquisição.
3. Usando uma objetiva de 10X, localize fatias cerebelares não alteradas que apresentem de 9 a 10 lóbulos (geralmente seções cerebelares próximas ao vermis).
4. Ative a aquisição de pilha z. Defina o intervalo da pilha z para incluir todas as células de Purkinje presentes na fatia cerebelar. Defina um tamanho de passo de 2 μm e inicie a aquisição. Salve a imagem adquirida no formato do fabricante do software de aquisição para preservar os metadados associados.
5. Abra o arquivo adquirido no ImageJ usando o plugin Bio-formats.
6. Vá para Pilhas de > de imagem > projeto Z... (Figura 2A).
7. Escolha Intensidade máxima no menu suspenso Tipo de projeção e clique em OK (Figura 2B).
8. Uma imagem 2D achatada será gerada. Clique duas vezes na ferramenta Multiponto para deixar a janela Ferramenta Ponto aparecer. Desmarque a opção Rotular pontos para facilitar a visualização das células contadas. Em seguida, clique diretamente em um soma de uma célula de Purkinje para começar a contar (Figura 1E). O número total de células contadas será indicado na parte inferior da janela da Ferramenta Ponto (Figura 3).
   nota: Normalmente, pelo menos 3 seções não danificadas contendo 9 a 10 lóbulos por inserção de cultura de células podem ser quantificadas. Para avaliar o efeito neuroprotetor de um agente farmacológico, pelo menos 3 experimentos independentes devem ser realizados.

Resultados

Figura 1: Ilustração do protocolo desde a dissecção até a quantificação da sobrevivência das células de Purkinje. O filhote de rato é rapidamente decapitado (A). Após a dissecção do cérebro, o cerebelo é isolado (B) e, em seguida, cortado em fatias de 350 μm de largura (C). As secções cerebelares são colocadas num folheto de cultura de células de con...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 594 Anticorpo secundário anti-IgG de camundongo de burro	ThermoFisher científico	A21203
Águia Média Basal (BME)	ThermoFisher científico	21010046
Armário de biossegurança Classe II, Tipo A2	NuAire	NU-540-400
Albumina de soro bovino	Millipore Sigma	A2153
escova
Anticorpo anti-Calbindina D-28K (CB-955)	Abcam	AB82812
Incubadora de CO2	NuAire	NU-5700
Placas de Cultura de Células de Fundo Plano Corning Costar de 6 poços	Fisher Científico	200/07/83
Lamínulas, 22 x 50 mm	Fisher Científico	12-545-E
Pinça de curativo reta	Aparelho de Harvard	Rolamento 72-8949
Lâminas de borda dupla	Fisher Científico	50949411
Prova de etanol 200	Decon Labs, Inc	2701
Tesoura de olho, reta	Aparelho de Harvard	Telefone: 72-8428
Pinça fina	Fisher Científico	16-100-127
L-Glutamina 100X	ThermoFisher científico	25030149
Solução de glicose	ThermoFisher científico	A2494001
Solução salina balanceada de Hanks	ThermoFisher científico	14025092
Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato	Fisher Científico	H21492
Soro de cavalo, inativado pelo calor, origem neozelandesa	ThermoFisher científico	26050088
ImagemJ
Picador de Tecidos McIlwain	Fisher Científico	NC9914528
Microssondas	Fisher Científico	Nº 08-850
Inserções de cultura de células Millicell	Millipore Sigma	PICM0RG50
Unidades de filtro descartáveis estéreis de fluxo rápido Nalgene com membrana PES, 250 mL	ThermoFisher científico	Rolamento 168-0045
Sistema de microscópio a laser confocal Nikon A1R	Nikon
Software de imagem NIS-Elements	Nikon
Paraformaldeído	Acros Orgânicos	Rolamento 41678-0010
Pipetas Pasteur	Fisher Científico	13-678-20D
Cloreto de potássio	Fisher Científico	BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher científico	Pág. 10144
Tesoura de operação, reta	Aparelho de Harvard	Telefone: 72-8403
Agitador orbital Dançarina do Ventre	IBI Científico	BDRLS0003
Prisma 8	GraphPad
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	Fisher Científico	12-550-15
Placa de cultura de tecidos, 60 mm com anel de aderência	Fisher Científico	FB012921
Placa de cultura de tecidos, 24 poços	Falcão / Corning	353047
Pipetas de transferência estéreis	ThermoFisher científico	13-711-21
Tritão X-100	ThermoFisher científico	BP151-500