Dissociação e cultura de neurônios de amostras de tecido hipocampal

Resumo

Fonte: Servello, D. et al., Um sistema microbiomecânico para estudar a formação e recuperação de varicosidades em axônios de neurônios centrais. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a dissociação e cultura de neurônios do hipocampo a partir de amostras de tecido do hipocampo usando dissociações enzimáticas e mecânicas. O tratamento com Ara-C inibe o crescimento de células não neuronais, facilitando o crescimento seletivo dos neurônios do hipocampo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Dissecação, dissociação e cultura de neurônios do hipocampo de camundongos/ratos prenhes

1. Dissecção e dissociação de neurônios do hipocampo para cultura
   1. Descongelar a solução enzimática de protease (3 mg/ml de protease 23 em solução de dissecação de fatias, SLDS, quadro 1) e meios de pré-aquecimento (quadro 2) a 37 °C.
   2. Dissecar o hipocampo e enxaguar com SLDS.
      nota: Quatro hipocampos fornecem células suficientes para uma placa de 24 ou 6 poços.
   3. Remova o SLDS, adicione 2 mL de solução enzimática de protease e incube a amostra a 37 ° C, 5% CO₂, por 15 min.
   4. Lave os explantes do hipocampo com 5-10 mL de meio de revestimento duas vezes. Adicione 5 mL de meio de revestimento. Dissocie os explantes do hipocampo em células únicas, gerando um pequeno vórtice usando uma pipeta com uma ponta de plástico de 1 mL. Pipete para cima e para baixo cerca de 40 vezes, evitando a formação de bolhas de oxigênio, até que a solução fique turva e não restem pedaços grandes de explante.
      nota: Lembre-se de deixar alguns meios durante as lavagens, os explantes do hipocampo devem permanecer submersos no meio durante todo o processo.
   5. Centrifugar as células a 1.125 x g durante 3 min. Retirar o sobrenadante com as células submersas no meio. Ressuspenda as células em 145 mL de meio de plaqueamento. Adicione 1 mL/poço da suspensão celular a uma placa de 24 poços (3 mL/poço a uma placa de 6 poços).
      NOTA: 145 mL de meio de revestimento são usados para produzir uma suspensão celular com baixa densidade celular. Este volume permitirá o revestimento de células em seis placas de 24 poços, oito placas de 6 poços ou várias combinações de placas de 24 ou 6 poços, dependendo dos experimentos a serem realizados. Cada poço da placa de 24 poços terá cerca de 3 x 10⁴ células.
   6. Incube as células no meio de revestimento a 37 °C, 5% de CO₂ por 2-4 h, depois remova todos os meios de revestimento e substitua-os por novos meios de manutenção.
   7. Após 2 dias (2 dias in vitro, 2DIV), substitua metade do meio por 2 μM de Ara-C (arabinosilcitosina) dissolvido em meio de manutenção, que inibe o crescimento de fibroblastos, células endoteliais e gliais. Depois de expor as células ao Ara-C por dois dias, substitua o meio por um novo meio de manutenção.

Tabela 1: Solução de revestimento de lamínula. Fornece a receita para preparar a solução de revestimento de lamínula usada para aderir as células cultivadas às lamínulas.

Solução de revestimento de lamínula
780 μL	Ácido acético17 mM estoque: 50 μL de ácido acético em 50 mL de H2O
200 μL	Poli-D-lisina (estoque de 0,5 mg/mL)
20 μL	Colágeno de cauda de rato (estoque de 3 mg/mL)
O volume total é determinado com base no número de lamínulas a serem revestidas.

Tabela 2: Receitas de meios de cultura celular. Fornece as receitas para a preparação de meios utilizados na cultura de células neurais primárias do hipocampo.

1x Solução de dissecção de fatias (SLDS), filtrada, pH= 7,4, armazenar a 4 °C
1 L	ddH2O
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
10 mM	HEPES (ácido livre)
10 mM	D-glicose
5 mM	MgCl2
0.00%	Vermelho de fenol (opcional)
Mídia de galvanização (PM, filtro, armazenar a 4 °C)
439 mL	Sais de MEM Earle
50 mL	FBS
11,25 ml	20% de D-glicose
5 ml	Piruvato de sódio (100 mM,)
62,5 μL	L-glutamina (200 mM)
5 ml	Penicilina/Estreptomicina (P/S, 100x)
Meios de manutenção (MM, filtro, armazenar a 4 °C)
484 mL	Neurobasal
10 mL	Suplemento B27 50x
1,25 mL	L-glutamina (200 mM)
5 ml	100x P/S
Todas as soluções são esterilizadas usando um filtro com tamanho de poro de 0,2 mm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
lamínulas de 12 mm	Warner Instruments	Telefone: 64-0702	Para placa de 24 poços
lamínulas de 25 mm	Fisher Científico	12-545-102	Para placa de 6 poços
ácido acético	Fisher Científico	A38-212
Poli-D-lisina	sigma	Pág. 6407
Colágeno de cauda de rato	Roche	11 179 179 001
10X PBS	Diagnósticos Nacionais	CL-253
Na2SO4	Fisher Científico	S373-500
K2SO4	Fisher Científico	Pág. 304-500
HEPES	Fisher Científico	BP410-500
D-glicose	Fisher Científico	D16-500
MgCl2	Fisher Científico	BP214-500
NaOH	Fisher Científico	SS255-1
Enzima protease	sigma	Pág. 4032
FBS	Gibco	Rolamento 26140
Piruvato de sódio	Gibco	Rolamento 11360-070
L-glutamina	Gibco	25030081
Penicilina/Estreptomicina 100x (P/S)	Gibco	15140122
Sais de MEM Earle	Gibco	11090
Suplemento B27	Gibco	Rolamento 17504-044
Neurobasal	Gibco	Rolamento 21103-049
Arabinosilcitosina (Ara-C)	sigma	147-94-4
Mídia Opti-MEM	Gibco	Rolamento 31985-070