Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em oligodendrócitos

Resumo

Fonte: Assetta, B., et al. Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos. J. Vis. Exp (2020).

Este vídeo demonstra o processo de geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) a partir de células-tronco embrionárias humanas, seguido pela maturação de OPCs em oligodendrócitos. Esse processo de geração de oligodendrócitos abre vários caminhos para melhorar a pesquisa e o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Protocolo

1. Indução de células precursoras de oligodendrócitos humanos (OPC) a partir de células-tronco pluripotentes e maturação de oligodendrócitos

1. Geração de células progenitoras neurais (NPC): protocolo de monocamada (~7 dias). Consulte a Figura 1A para obter o fluxo.
   1. Use células ES humanas H1 disponíveis comercialmente na passagem de 52 (ver Tabela de Materiais). Cultive as células em placas de 6 poços revestidas com solução de matriz extracelular (~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços; consulte a Tabela de Materiais) usando meio de manutenção de células ES (consulte a Tabela de Materiais) e incube as placas a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. Transdiferencie as células em células progenitoras neurais (NPCs) por uma abordagem estabelecida chamada SMADi duplo, com inibidores de moléculas pequenas para múltiplas vias de sinalização. Aqui usamos um kit comercial amplamente aceito e seguimos o protocolo monocamada fornecido pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   3. No Dia -1, coloque 0,5–1 x 10⁶ células por poço em uma placa de 6 poços revestida por uma solução de matriz reduzida por fator de crescimento (ver Tabela de Materiais; ~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços) com meio de manutenção de células-tronco embrionárias (ES) (ver Tabela de Materiais). Esta solução de matriz reduzida por fator de crescimento é usada para revestir todas as placas que serão usadas nas etapas a seguir.
   4. No Dia 0, trate as células por 24 h com meio de manutenção de células ES (ver Tabela de Materiais) suplementado com 2% de dimetilsulfóxido (DMSO).
   5. Nos dias 1 a 6, troque o meio completo por um meio de indução neural quente (37 ° C) contendo os inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais). Se as células se dividirem e atingirem a confluência antes do dia 7, passe-as para a densidade de semeadura de 0,5–1 x 10⁶, conforme descrito anteriormente na etapa 1.1.3.
   6. No dia 7, passe NPCs usando solução de desprendimento de células (ver Tabela de Materiais) e placa em uma densidade de semeadura de 1–2 x 10⁵ células/poço de uma placa de 24 poços.
   7. Eficiência de diferenciação do ensaio por coloração imuno-histoquímica (IHC) para a ausência de marcadores de pluripotência, como OCT4, e a presença de marcadores NPC, como PAX6, Nestin e Sox1.
   8. Nesta fase, os NPCs destacados podem ser congelados no meio de congelamento comercial especializado de NPCs (consulte a Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Depois de congelar e descongelar pela primeira vez, os NPCs ainda mantêm a multipotência para dar origem a neurônios, astrócitos e OPCs com protocolos confiáveis.
2. Geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPC) (~7 dias). Consulte a Figura 1A para obter o fluxograma.
   1. No dia 7, passe os NPCs usando solução de descolamento celular (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-os em uma densidade de semeadura de 1–2 x 10,5 células por poço em uma placa de 24 poços em meio de indução neural quente (37 ° C) mais inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais).
   2. No dia 8, prepare uma solução de DMSO a 1% no meio de diferenciação OPC e trate os NPCs plaqueados por 24 h. O meio de diferenciação OPC é composto por: meio basal (DMEM/F12), suplemento de N2 a 1%, suplemento de B27 a 1%, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a 20 ng/mL, agonista suavizado (SAG) a 1 μM, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA) a 10 ng/mL (ver Tabela de Materiais).
   3. No dia 9, substitua o meio por um novo meio de diferenciação OPC sem DMSO. Alimente as células em dias alternados até o dia 15. Se as células atingirem a confluência antes do dia 15, passe-as para a densidade de semeadura de 1–2 x 10⁵ células por poço, conforme descrito na etapa 1.2.1.
   4. No dia 14, coloque OPCs em meio de diferenciação OPC a uma densidade de 1–2 x 10⁵ células/poço em uma placa de 24 poços.
   5. Nesta fase (Dia 15), testar as células para a presença de marcadores específicos de OPC por coloração imuno-histoquímica (IHC) ou reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) (por exemplo, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Figura 1B) e pela ausência de marcadores NPC (Pax6 ou Nestin; Figura 1D). Normalmente detectamos a imunorreatividade do O4 em mais de 95% das células no dia 15. De particular relevância para a doença de Alzheimer, a expressão de APP (proteína precursora de amilóide), BACE1 (a protease de processamento β-secretase 1) e peptídeo amilóide-β (Aβ) são abundantes em OPCs (Figura 1F).
3. Maturação de oligodendrócitos (OL) (~ 7–20 dias)
   1. No dia 15, substitua o meio por meio de maturação OL: meio Neurobasal-A, suplemento de B27 a 2%, monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 1 μM, triiodotironina T3 200 ng/mL e clemastina de 1 μM (ver Tabela de Materiais). Mude o meio a cada dois dias ou todos os dias, se necessário.
   2. Quando as células atingirem 90% de confluência, divida-se na proporção de 1:3 até 2 passagens ou até que a divisão celular diminua substancialmente. Se os OPCs se dividirem muito rápido e atingirem a confluência em menos de 3 dias, adicione Ara-C (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração de 2–5 μM por 1–3 dias. A proliferação ativa indica menor eficiência de maturação.
   3. Examine a eficiência da maturação oligodendroglial avaliando a expressão de marcadores OL, por exemplo, CLDN11, PLP1, MBP por qPCR, coloração IHC ou immunoblotting. A morfologia característica de estruturas altamente complexas (Figura 1C) e a expressão de marcadores OL (Figura 1E) devem ser prontamente detectadas no dia 28.

Resultados

Figura 1: Geração de iOPC (célula precursora de oligodendrócitos induzidos) e maturação de iOL (oligodendrócitos induzidos). (A) Fluxograma de geração de iOPC e iOL. (B) Imagens representativas de campo claro e imunofluorescência de iOPCs no dia 15. Olig2 (marcador pan-oligodendroglia) é mostrado em verde, O4 (marcador OPC) em vermelho e DAPI em azul. A imagem revelo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase	Tecnologias STEMCELL	7920
Suplemento B27	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
acampamento	MilliporeSigma	A9501
Clemastina	MilliporeSigma	SML0445
Meio DMEM/F12	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Soro fetal bovino	ScienCell	10
Células ES humanas H1	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5825
Suplemento N2	ThermoFisher	17502001
Meio neurobasal A	ThermoFisher	Rolamento 10888-022
Aminoácidos não essenciais	ThermoFisher	Rolamento 11140-050
PDGF-AA	Sistemas de P&D	221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene	Rolamento 12251
Polibreno	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
Inibidor de ROCK Y-27632	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 72302
Sag	Tocris	Nº 4366
Mídia de congelamento de progenitor neural STEMdiff	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5838
Kit de indução neural STEMdiff SMADi	Tecnologias STEMCELL	Nº 8581
Triiodotironina T3	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo: OPCs derivados de iPSC humanos	Tempo BioScience	Referência102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	Rolamento 52047
VSV-G	Addgene	Rolamento 12259