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1. Indução de neurônios humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas
- Preparação de lentivírus (~5 dias)
- Placa ~ 1 milhão de células 293T (HEK293T) do rim embrionário humano em cada frasco T75, para que elas sejam ~ 40% confluentes ao realizar a transfecção. Transfecte-os com plasmídeos que expressam neurogenina 2 induzível por tetraciclina (Ngn2) e gene resistente à puromicina (PuroR; sob o mesmo controle do promotor do operador Tet (TetO), transativador reverso de tetraciclina (rtTA) e os três plasmídeos auxiliares pRSV-REV, pMDLg / pRRE e VSV-G (12 μg de DNA de vetor lentiviral e 6 μg de cada DNA de plasmídeo auxiliar). Preparar pelo menos três frascos por preparação de lentivírus. Use polietilenonimina (PEI) para transfecção seguindo as instruções do fabricante. Troque a mídia após 16 h e descarte.
- Colha partículas virais liberadas coletando meios de cultura todos os dias e substitua por meios frescos por 3 dias. Agrupe os meios coletados contendo partículas virais para purificação. Filtre o vírus através de um filtro de 0,22 μm e centrifugue a 49.000 x g por 90 min. Ressuspenda o pellet no volume apropriado de solução salina tamponada com fosfato (PBS) - glicose (~ 150 μL).
- Indução de neurônios (~5 dias)
nota: Este protocolo de indução (Figura 1A; diagrama de fluxo) é altamente eficaz para células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e células-tronco embrionárias (ES) de pluripotência validada (que pode ser testada por coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência bem caracterizados; Figura 1B).
- Use células ES humanas H1 disponíveis comercialmente na passagem de 52 (ver Tabela de Materiais). Cultive as células em placas de 6 poços revestidas com solução de matriz extracelular (~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços; consulte a Tabela de Materiais) usando meio de manutenção de células ES (consulte a Tabela de Materiais) e incube as placas a 37 ° C com 5% de CO2.
- No Dia -2, desconecte as células ES (80% confluentes) com 1 mL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 10 min. Transfira as células para um tubo; lave o poço com 2 mL de meio e misture no mesmo tubo. Centrifugue a 300 x g por 5 min, ressuspenda o pellet em meio e coloque as células em placas de 6 poços revestidas com matriz na densidade de semeadura de 1 x 105 células por poço.
- No Dia -1, adicione lentivírus expressando Ngn2 mais PuroR e rtTA junto com polibreno (8 μg / ml) às células ES em meio de manutenção de células ES fresco (ver Tabela de Materiais). O número exato de vírus deve ser determinado pelos títulos reais ou pela titulação. Normalmente, adicionamos 5 μL de cada vírus por poço em uma placa de 6 poços.
- No Dia 0, adicione doxiciclina (2 μg/mL, para ativar a expressão de Ngn2) no meio Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12) com suplemento de N2 sem morfogênios.
- No dia 1, adicione puromicina em meio fresco de DMEM-F12 mais N2 e doxiciclina, até a concentração final de 1 μg / mL de meio. Selecione as células transduzidas em Puromicina por pelo menos 24 h. Maior concentração de Puromicina (até 5 μg / mL) e período de seleção mais longo (até 48 h) podem ser necessários para remover adequadamente as células subtransduzidas se o título do vírus for baixo.
- No Dia 2, desconecte os neurônios diferenciadores com solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e recoloque-os em placas de 24 poços (entre 80.000–200.000 células/poço) revestidas com solução de matriz (ver Tabela de Materiais) e mantenha-os em meio neurobasal-A (NBA)/B27 sem doxiciclina. A densidade de semeadura é crítica.
- Nesta fase, os neurônios destacados podem ser congelados em meio de congelamento comercial especializado (ver Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Os neurônios puros podem ser plaqueados representando a morte celular típica de ~ 15% a 20% após o descongelamento, cultivados sozinhos ou co-cultivados com outros tipos de células cerebrais (consulte a etapa 3.2.3. para co-cultura com OPCs).
- Cultivar iNs puros nas placas revestidas com soluções baseadas em matriz extracelular, conforme instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). A morfologia piramidal característica deve ser aparente no Dia 4 (e no Dia 6; Figura 1C). A formação de sinapses pode ser detectada já nos dias 14 a 16 e é proeminente no dia 24 por coloração imuno-histoquímica com marcadores pré e pós-sinápticos padrão. (Figura 1D; marcado com o marcador pré-sináptico Sinapsina 1 e o marcador dendrítico Map2).
2. Indução de células precursoras de oligodendrócitos humanos (OPCs) a partir de células-tronco pluripotentes e maturação de oligodendrócitos
- Geração de células progenitoras neurais (NPC): protocolo de monocamada (~7 dias). Consulte a Figura 2A para obter o fluxograma.
- Cultive células ES humanas H1 conforme descrito anteriormente (consulte a etapa 1.2.1.) e transdiferencie-as em células progenitoras neurais (NPCs) por uma abordagem estabelecida chamada SMADi duplo, com inibidores de pequenas moléculas para múltiplas vias de sinalização. Aqui usamos um kit comercial amplamente aceito e seguimos o protocolo monocamada fornecido pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- No Dia -1, coloque 0,5–1 x 106 células por poço em uma placa de 6 poços revestida por uma solução de matriz reduzida por fator de crescimento (ver Tabela de Materiais; ~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços) com meio de manutenção de células ES (ver Tabela de Materiais). Esta solução de matriz reduzida com fator de crescimento é usada para revestir todas as placas que serão usadas nas etapas a seguir.
- No Dia 0, trate as células por 24 h com meio de manutenção de células ES (ver Tabela de Materiais) suplementado com 2% de DMSO.
- Nos dias 1 a 6, troque o meio completo por meio de indução neural quente (37 ° C) contendo os inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais). Se as células se dividirem e atingirem a confluência antes do dia 7, passe-as para a densidade de semeadura de 0,5–1 x 106, conforme descrito anteriormente na etapa 2.1.2.
- No dia 7, passe NPCs usando solução de desprendimento de células (ver Tabela de Materiais) e placa em uma densidade de semeadura de 1–2 x 105 células/poço de uma placa de 24 poços.
- Testar a eficiência de diferenciação por coloração imuno-histoquímica (IHC) para ausência de marcador de pluripotência, fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (OCT4), por exemplo, e presença de marcadores NPC, como caixa pareada 6 (PAX6), Nestin e fator de transcrição Y-box da região determinante do sexo 1 (Sox1).
- Nesta fase, os NPCs destacados podem ser congelados no meio de congelamento comercial especializado de NPCs (consulte a Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Depois de congelar e descongelar pela primeira vez, os NPCs ainda mantêm a multipotência para dar origem a neurônios, astrócitos e OPCs com protocolos confiáveis.
- Geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPC) (~7 dias). Consulte a Figura 2A para obter o fluxograma.
- No dia 7, passe os NPCs usando solução de descolamento celular (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-os em uma densidade de semeadura de 1–2 x 10,5 células por poço em uma placa de 24 poços em meio de indução neural quente (37 ° C) mais inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais).
- No dia 8, prepare uma solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% no meio de diferenciação OPC e trate os NPCs plaqueados por 24 h. O meio de diferenciação OPC é composto por: meio DMEM/F12, suplemento de N2 a 1%, suplemento de B27 a 1%, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a 20 ng/mL, agonista suavizado (SAG) a 1 μM, fator de crescimento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) a 10 ng/mL (ver Tabela de Materiais).
- No dia 9, substitua o meio por um novo meio de diferenciação OPC sem DMSO. Alimente as células em dias alternados até o dia 15. Se as células atingirem a confluência antes do dia 15, passe-as para a densidade de semeadura de 1–2 x 105 células por poço, conforme descrito na etapa 2.2.1.
- No dia 14, coloque OPCs em meio de diferenciação OPC a uma densidade de 1–2 x 105 células/poço em uma placa de 24 poços.
- Nesta fase (Dia 15), testar as células quanto à presença de marcadores específicos de OPC por coloração IHC ou qPCR (por exemplo, O4, fator de transcrição de linhagem de oligodendrócitos [Olig]-1/2, proteoglicano de sulfato de condroitina 4/antígeno neuroglial 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas [PDGFRa]; Figura 2B) e pela ausência de marcadores NPC (Pax6 ou Nestin; Figura 2D). Normalmente detectamos a imunorreatividade do O4 em mais de 95% das células no dia 15. De particular relevância para a doença de Alzheimer, a expressão de APP (proteína precursora de amilóide), BACE1 (a protease de processamento β-secreatase 1) e peptídeo amilóide-β (Aβ) é abundante em OPCs ( Figura 2F ).
3. Co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos (iOPCs)
- Revestimento iOPC (~3 dias)
- Placas iOPCs no dia 14 a uma densidade de 1 x 10,5 células por poço em uma placa de 24 poços (conforme descrito acima na etapa 2.2.4.) em meio de diferenciação OPC (conforme descrito na etapa 2.2.2.).
- Criação de co-cultura iN-iOPC
- No dia 15, desprenda os neurônios humanos induzidos na etapa do dia 2 após a seleção de puromicina (conforme descrito na etapa 1.2.6.) com solução de descolamento celular (consulte a Tabela de Materiais).
- Adicione neurônios aos OPCs cultivados, plaqueando na densidade de semeadura de 2 x 105 células por poço na placa de 24 poços com OPCs em crescimento (da etapa 3.1.1). Use o meio de co-cultura contendo meio Neurobasal-A, suplemento de B27 a 2% e 100 ng/mL de triiodotironina T3. Mude o meio no dia seguinte e depois em dias alternados. Se os OPCs proliferarem muito rápido e atingirem a confluência em menos de 3 dias, adicione citosina arabinosídeo (Ara-C) a uma concentração de 2–5 μM. Uma imagem representativa dos iNs e iOPCs cultivados em co-cultura após 7 dias de neurônios é mostrada na Figura 3A.
- Use neurônios congelados preparados conforme descrito acima na etapa 1.2.7 para co-cultura com OPCs. Neurônios de congelamento e descongelamento de placas em uma densidade mais alta de 3 x 105 células por poço.
- Após o dia 14-16 em co-culturas, a formação de sinapses em iNs pode ser observada pela coloração IHC de marcadores pré e pós-sinápticos, e no dia 21 os pontos sinápticos devem ser abundantes ( Figura 3C ) e as atividades neuronais podem ser registradas de forma confiável.
- A partir do dia 21, teste as células para marcadores específicos de OL (por exemplo, proteína básica de mielina [MBP] e proteína proteolipídica 1 [PLP1]). No dia 28, normalmente observamos o fenômeno de embainhamento de axônios iN por processos iOL, marcados por coloração IHC para marcadores específicos (Figura 3B; neurofilamento [NF] para axônios iN e MBP para processos iOPC).
