Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

Resumo

Fonte: Assetta, B.,et al. Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Protocolo

1. Indução de neurônios humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

1. Preparação de lentivírus (~5 dias)
   1. Placa ~ 1 milhão de células 293T (HEK293T) do rim embrionário humano em cada frasco T75, para que elas sejam ~ 40% confluentes ao realizar a transfecção. Transfecte-os com plasmídeos que expressam neurogenina 2 induzível por tetraciclina (Ngn2) e gene resistente à puromicina (PuroR; sob o mesmo controle do promotor do operador Tet (TetO), transativador reverso de tetraciclina (rtTA) e os três plasmídeos auxiliares pRSV-REV, pMDLg / pRRE e VSV-G (12 μg de DNA de vetor lentiviral e 6 μg de cada DNA de plasmídeo auxiliar). Preparar pelo menos três frascos por preparação de lentivírus. Use polietilenonimina (PEI) para transfecção seguindo as instruções do fabricante. Troque a mídia após 16 h e descarte.
   2. Colha partículas virais liberadas coletando meios de cultura todos os dias e substitua por meios frescos por 3 dias. Agrupe os meios coletados contendo partículas virais para purificação. Filtre o vírus através de um filtro de 0,22 μm e centrifugue a 49.000 x g por 90 min. Ressuspenda o pellet no volume apropriado de solução salina tamponada com fosfato (PBS) - glicose (~ 150 μL).
2. Indução de neurônios (~5 dias)
   nota: Este protocolo de indução (Figura 1A; diagrama de fluxo) é altamente eficaz para células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e células-tronco embrionárias (ES) de pluripotência validada (que pode ser testada por coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência bem caracterizados; Figura 1B).
   1. Use células ES humanas H1 disponíveis comercialmente na passagem de 52 (ver Tabela de Materiais). Cultive as células em placas de 6 poços revestidas com solução de matriz extracelular (~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços; consulte a Tabela de Materiais) usando meio de manutenção de células ES (consulte a Tabela de Materiais) e incube as placas a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. No Dia -2, desconecte as células ES (80% confluentes) com 1 mL de solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 10 min. Transfira as células para um tubo; lave o poço com 2 mL de meio e misture no mesmo tubo. Centrifugue a 300 x g por 5 min, ressuspenda o pellet em meio e coloque as células em placas de 6 poços revestidas com matriz na densidade de semeadura de 1 x 10⁵ células por poço.
   3. No Dia -1, adicione lentivírus expressando Ngn2 mais PuroR e rtTA junto com polibreno (8 μg / ml) às células ES em meio de manutenção de células ES fresco (ver Tabela de Materiais). O número exato de vírus deve ser determinado pelos títulos reais ou pela titulação. Normalmente, adicionamos 5 μL de cada vírus por poço em uma placa de 6 poços.
   4. No Dia 0, adicione doxiciclina (2 μg/mL, para ativar a expressão de Ngn2) no meio Eagle modificado de Dulbecco/mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12) com suplemento de N2 sem morfogênios.
   5. No dia 1, adicione puromicina em meio fresco de DMEM-F12 mais N2 e doxiciclina, até a concentração final de 1 μg / mL de meio. Selecione as células transduzidas em Puromicina por pelo menos 24 h. Maior concentração de Puromicina (até 5 μg / mL) e período de seleção mais longo (até 48 h) podem ser necessários para remover adequadamente as células subtransduzidas se o título do vírus for baixo.
   6. No Dia 2, desconecte os neurônios diferenciadores com solução de descolamento celular (ver Tabela de Materiais) e recoloque-os em placas de 24 poços (entre 80.000–200.000 células/poço) revestidas com solução de matriz (ver Tabela de Materiais) e mantenha-os em meio neurobasal-A (NBA)/B27 sem doxiciclina. A densidade de semeadura é crítica.
   7. Nesta fase, os neurônios destacados podem ser congelados em meio de congelamento comercial especializado (ver Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Os neurônios puros podem ser plaqueados representando a morte celular típica de ~ 15% a 20% após o descongelamento, cultivados sozinhos ou co-cultivados com outros tipos de células cerebrais (consulte a etapa 3.2.3. para co-cultura com OPCs).
   8. Cultivar iNs puros nas placas revestidas com soluções baseadas em matriz extracelular, conforme instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). A morfologia piramidal característica deve ser aparente no Dia 4 (e no Dia 6; Figura 1C). A formação de sinapses pode ser detectada já nos dias 14 a 16 e é proeminente no dia 24 por coloração imuno-histoquímica com marcadores pré e pós-sinápticos padrão. (Figura 1D; marcado com o marcador pré-sináptico Sinapsina 1 e o marcador dendrítico Map2).

2. Indução de células precursoras de oligodendrócitos humanos (OPCs) a partir de células-tronco pluripotentes e maturação de oligodendrócitos

1. Geração de células progenitoras neurais (NPC): protocolo de monocamada (~7 dias). Consulte a Figura 2A para obter o fluxograma.
   1. Cultive células ES humanas H1 conforme descrito anteriormente (consulte a etapa 1.2.1.) e transdiferencie-as em células progenitoras neurais (NPCs) por uma abordagem estabelecida chamada SMADi duplo, com inibidores de pequenas moléculas para múltiplas vias de sinalização. Aqui usamos um kit comercial amplamente aceito e seguimos o protocolo monocamada fornecido pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   2. No Dia -1, coloque 0,5–1 x 10⁶ células por poço em uma placa de 6 poços revestida por uma solução de matriz reduzida por fator de crescimento (ver Tabela de Materiais; ~ 0,5 mg de solução de matriz por placa de 6 poços) com meio de manutenção de células ES (ver Tabela de Materiais). Esta solução de matriz reduzida com fator de crescimento é usada para revestir todas as placas que serão usadas nas etapas a seguir.
   3. No Dia 0, trate as células por 24 h com meio de manutenção de células ES (ver Tabela de Materiais) suplementado com 2% de DMSO.
   4. Nos dias 1 a 6, troque o meio completo por meio de indução neural quente (37 ° C) contendo os inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais). Se as células se dividirem e atingirem a confluência antes do dia 7, passe-as para a densidade de semeadura de 0,5–1 x 10⁶, conforme descrito anteriormente na etapa 2.1.2.
   5. No dia 7, passe NPCs usando solução de desprendimento de células (ver Tabela de Materiais) e placa em uma densidade de semeadura de 1–2 x 10⁵ células/poço de uma placa de 24 poços.
   6. Testar a eficiência de diferenciação por coloração imuno-histoquímica (IHC) para ausência de marcador de pluripotência, fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (OCT4), por exemplo, e presença de marcadores NPC, como caixa pareada 6 (PAX6), Nestin e fator de transcrição Y-box da região determinante do sexo 1 (Sox1).
   7. Nesta fase, os NPCs destacados podem ser congelados no meio de congelamento comercial especializado de NPCs (consulte a Tabela de Materiais) e armazenados em nitrogênio líquido por até 3 meses. Depois de congelar e descongelar pela primeira vez, os NPCs ainda mantêm a multipotência para dar origem a neurônios, astrócitos e OPCs com protocolos confiáveis.
2. Geração de células precursoras de oligodendrócitos (OPC) (~7 dias). Consulte a Figura 2A para obter o fluxograma.
   1. No dia 7, passe os NPCs usando solução de descolamento celular (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-os em uma densidade de semeadura de 1–2 x 10,5 células por poço em uma placa de 24 poços em meio de indução neural quente (37 ° C) mais inibidores de SMAD do kit comercial (consulte a Tabela de Materiais).
   2. No dia 8, prepare uma solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% no meio de diferenciação OPC e trate os NPCs plaqueados por 24 h. O meio de diferenciação OPC é composto por: meio DMEM/F12, suplemento de N2 a 1%, suplemento de B27 a 1%, fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a 20 ng/mL, agonista suavizado (SAG) a 1 μM, fator de crescimento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) a 10 ng/mL (ver Tabela de Materiais).
   3. No dia 9, substitua o meio por um novo meio de diferenciação OPC sem DMSO. Alimente as células em dias alternados até o dia 15. Se as células atingirem a confluência antes do dia 15, passe-as para a densidade de semeadura de 1–2 x 10⁵ células por poço, conforme descrito na etapa 2.2.1.
   4. No dia 14, coloque OPCs em meio de diferenciação OPC a uma densidade de 1–2 x 10⁵ células/poço em uma placa de 24 poços.
   5. Nesta fase (Dia 15), testar as células quanto à presença de marcadores específicos de OPC por coloração IHC ou qPCR (por exemplo, O4, fator de transcrição de linhagem de oligodendrócitos [Olig]-1/2, proteoglicano de sulfato de condroitina 4/antígeno neuroglial 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas [PDGFRa]; Figura 2B) e pela ausência de marcadores NPC (Pax6 ou Nestin; Figura 2D). Normalmente detectamos a imunorreatividade do O4 em mais de 95% das células no dia 15. De particular relevância para a doença de Alzheimer, a expressão de APP (proteína precursora de amilóide), BACE1 (a protease de processamento β-secreatase 1) e peptídeo amilóide-β (Aβ) é abundante em OPCs ( Figura 2F ).

3. Co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos (iOPCs)

1. Revestimento iOPC (~3 dias)
   1. Placas iOPCs no dia 14 a uma densidade de 1 x 10,⁵ células por poço em uma placa de 24 poços (conforme descrito acima na etapa 2.2.4.) em meio de diferenciação OPC (conforme descrito na etapa 2.2.2.).
2. Criação de co-cultura iN-iOPC
   1. No dia 15, desprenda os neurônios humanos induzidos na etapa do dia 2 após a seleção de puromicina (conforme descrito na etapa 1.2.6.) com solução de descolamento celular (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Adicione neurônios aos OPCs cultivados, plaqueando na densidade de semeadura de 2 x 10⁵ células por poço na placa de 24 poços com OPCs em crescimento (da etapa 3.1.1). Use o meio de co-cultura contendo meio Neurobasal-A, suplemento de B27 a 2% e 100 ng/mL de triiodotironina T3. Mude o meio no dia seguinte e depois em dias alternados. Se os OPCs proliferarem muito rápido e atingirem a confluência em menos de 3 dias, adicione citosina arabinosídeo (Ara-C) a uma concentração de 2–5 μM. Uma imagem representativa dos iNs e iOPCs cultivados em co-cultura após 7 dias de neurônios é mostrada na Figura 3A.
   3. Use neurônios congelados preparados conforme descrito acima na etapa 1.2.7 para co-cultura com OPCs. Neurônios de congelamento e descongelamento de placas em uma densidade mais alta de 3 x 10⁵ células por poço.
   4. Após o dia 14-16 em co-culturas, a formação de sinapses em iNs pode ser observada pela coloração IHC de marcadores pré e pós-sinápticos, e no dia 21 os pontos sinápticos devem ser abundantes ( Figura 3C ) e as atividades neuronais podem ser registradas de forma confiável.
   5. A partir do dia 21, teste as células para marcadores específicos de OL (por exemplo, proteína básica de mielina [MBP] e proteína proteolipídica 1 [PLP1]). No dia 28, normalmente observamos o fenômeno de embainhamento de axônios iN por processos iOL, marcados por coloração IHC para marcadores específicos (Figura 3B; neurofilamento [NF] para axônios iN e MBP para processos iOPC).

Resultados

Figura 1: Geração direta de neurônios induzidos por humanos (iNs) a partir de hPSCs. (A) Fluxograma de geração de iN. (B) Imagens representativas de campo claro e imunofluorescência da cultura inicial de células-tronco pluripotentes humanas (H1) para confirmar a pluripotência. Oct4 é mostrado em vermelho e Sox2 em verde. (C) Imagens representativas d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase	Tecnologias STEMCELL	7920
Suplemento B27	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
acampamento	MilliporeSigma	A9501
Clemastina	MilliporeSigma	SML0445
Meio DMEM/F12	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Doxiciclina	MilliporeSigma	D3072
Soro fetal bovino	ScienCell	10
Células ES humanas H1	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5825
Suplemento N2	ThermoFisher	17502001
Meio neurobasal A	ThermoFisher	Rolamento 10888-022
Aminoácidos não essenciais	ThermoFisher	Rolamento 11140-050
PDGF-AA	Sistemas de P&D	221-AA-010
Pei	VWR	Rolamento 71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	Rolamento 12251
Polibreno	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	12253
Puromicina	ThermoFisher	A1113803
Inibidor de ROCK Y-27632	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 72302
Sag	Tocris	Nº 4366
Mídia de congelamento de progenitor neural STEMdiff	Tecnologias STEMCELL	Rolamento 5838
Kit de indução neural STEMdiff SMADi	Tecnologias STEMCELL	Nº 8581
Triiodotironina T3	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo: OPCs derivados de iPSC humanos	Tempo BioScience	Referência102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	Rolamento 52047
VSV-G	Addgene	Rolamento 12259